graines de C. australe et M. truncatula
2.2.1-Les intensités d’expression des gènes sont-elles globalement
comparables entre C. australe et M. truncatula ?
L’objectif est de comparer les intensités d’expression des gènes entre les deux espèces pour tenter de rapprocher chaque stade de développement de C. australe d’un stade caractérisé chez M. truncatula. Comme les données transcriptomiques des deux espèces ont été obtenues sur des lames différentes et à partir de plans d’hybridation différents, au préalable, il est nécessaire de s’assurer que ces intensités sont globalement comparables entre C. australe et M. truncatula afin d’éviter des erreurs d’interprétation. La valeur médiane des intensités associées aux 15 083 sondes a donc été calculée pour les différents échantillons utilisés dans notre analyse (Figure 3.6A). Elle est du même ordre de grandeur pour presque tous les échantillons (log intensité compris entre 3,5 et 4). Elle est cependant plus élevée pour le stade 14 DAF (4,58) et plus basse pour le stade ABS (2,92) au cours du développement des graines A17. Un problème de normalisation n’est pas forcément à l’origine de ces différences. En effet, l’activité transcriptionnelle générale est très importante en fin d’embryogenèse/début de remplissage alors qu’elle diminue en fin de développement dans les graines d’A. thaliana (Le et al., 2010). L’intensité médiane sur l’ensemble des gènes est donc logiquement plus élevée en
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C. australe R108 Radicule R108 Mtabi3-2 16 DAF 24 DAF 32 DAF 40 DAF 16 DAF 24 DAF 32 DAF 40 DAF Radic CaB CaY CaGB
16 DAF 24 DAF 32 DAF 40 DAF C. australe R108 Radicule R108 Mtabi3-2 CaB CaY CaG 16 DAF 24 DAF 32 DAF 40 DAF RadicFigure 3.7. Analyse en composantes principales (ACP) de l’expression des gènes préférentiellement exprimés dans les graines de C. australe, M. truncatula R108 et Mtabi3-2.
Basé sur les données d’expression dans différents tissus de M. truncatula, 991 sondes (sur 102 123) ont été identifiées comme associées à des gènes préférentiellement exprimés dans les graines. Parmi ces sondes, 273 correspondent à des gènes dont des homologues ont été identifiés dans le transcriptome de C. australe. L’ACP présenté ici est basée sur l’expression de ces 273 sondes au cours du développement des graines de C. australe (bleu), M. truncatula R108 (orange) et Mtabi3-2 (vert). Le stade radicule (violet) correspond aux gènes exprimés dans une radicule de 2,7 mm. La visualisation 3D est représentée sur deux plans : selon les axes X et Y (respectivement 35% et 28% de la variation totale des données) (A) puis selon les axes Y et Z(13% de la variation totale des données) (B).
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début de développement qu’en fin de développement. A titre comparatif, l’intensité maximale (en log) observée pour chaque échantillon est située entre 8 et 8,5.Les intensités médianes des gènes exprimés aux différents stades de développement des graines A17, R108, Mtabi3-2 et C. australe ont été placés le long d’un axe allant de l’embryogenèse à la germination (Figure 3.6A). Comme le développement des graines R108 est légèrement plus rapide que celui des graines A17, le stade 16 DAF R108 est proche du stade 20 DAF A17 tout comme le stade 24 DAF R108 est proche du stade 26 DAF A17. De même le stade 40 DAF R108 correspond à l’abscission de la graine et doit être rapproché du stade ABS de A17 plutôt que du stade 41 DAF. Le développement des graines Mtabi3-2 suit la même chronologie que chez le sauvage R108, les différents stades Mtabi3-2 ont donc été placés au même niveau que pour R108.
Après vérification de l’homogénéité des données transcriptomiques grâce au calcul de l’intensité médiane sur l’ensemble des sondes, nous avons analysé un jeu de données restreint dont le niveau d’expression est susceptible de varier au cours du développement des graines : les gènes préférentiellement exprimés dans les graines. Ces gènes ont été identifiés à partir de données transcriptomiques issues de différents tissus de M. truncatula (feuille, tige, racine, graine). Ils ont été définis comme étant les gènes au moins cinq fois plus exprimés dans les graines que dans les autres tissus. Sur les 15 083 gènes analysés, 273 sont préférentiellement exprimés dans les graines. La valeur médiane des intensités associées à ces gènes montre des variations très importante au cours du développement de M. truncatula (Figure 3.6B). Elle augmente progressivement au cours du remplissage jusqu’à atteindre son maximum à 32 DAF (log intensité médiane > 5) avant de diminuer en fin de développement pour les graines des deux génotypes. Comme attendu pour des gènes préférentiellement exprimés dans les graines, la valeur médiane est très faible (1,74) dans les autres tissus, comme les radicules R108 lors de la germination. L’évolution de la valeur médiane est différente pour les graines Mtabi3-2. Elle augmente plus tardivement que chez les graines sauvages R108 et ne diminue pas en fin de développement car elle atteint son maximum au stade 40 DAF. Cette différence majeure chez le mutant suggère un retard général du développement des graines en l’absence de l’expression du gène ABI3. La valeur médiane d’expression de ces 273 gènes préférentiellement exprimés dans les graines nous donne une indication pour placer les trois stades de C. australe sur cet axe de développement. En effet, pour les stades immature et mi-mature, elle est respectivement très proche des stades 16 DAF et 24 DAF des graines R108. Elle diminue ensuite fortement dans les graines matures pour atteindre une valeur proche de celle observée à l’abscission des graines A17 et R108. Cependant, ces graines ont été récoltées dans l’arbre avant l’abscission ce qui explique leur position légèrement en avant de l’abscission sur l’axe de développement.
2.2.2-Analyse en composantes principales
Pour aller plus loin dans le rapprochement des stades de développement entre les graines de M. truncatula et de C. australe, les valeurs d’intensité des 273 sondes liées aux gènes préférentiellement exprimés dans les graines ont été analysées en composantes principales (ACP). Pour plus de clarté, les stades de développement des graines A17 ne sont pas figurés sur les figures 3.7A et 3.7B. Le premier axe, qui explique 35 % de la variation, montre une séparation claire entre les échantillons de M. truncatula et ceux de C. australe. L’effet espèce est donc important (Figure 3.7A). Les axes Y et Z, qui expliquent respectivement 28 % et 13 % de la variation, mettent en évidence l’évolution au cours du développement des graines de M.
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Figure 3.8. Intensité d’expression des gènes codant pour les régulateurs majeurs de la maturation au cours du développement des graines de C. australe, M. truncatula A17, R108 et Mtabi3-2.
A) L’évolution de l’expression des gènes codant pour les régulateurs majeurs de la maturation des graines est représentée au cours du développement : Leafy cotyledon-1 (LEC1), FUSCA3 (FUS3), basic Leucine Zipper67 (bZIP67), basic Leucine Zipper12 (bZIP12 appelé aussi EEL), basic Leucine Zipper53 (bZIP53), ABA-insensitive-5 (ABI5), ABA-insensitive-4 (ABI4), Phytochrome Interacting factor3 like5 (PIL5), SOMNUS et ABA-insensitive-3 (ABI3) ainsi que des répresseurs majeurs de la maturation Pickle (PKL), Suppressor of abi3-5 (SUA), ABI3-interacting protein (AIP2), like2 (VAL2) et VP1/ABI3-like3 (VAL3). L’intensité d’expression est visualisée sous la forme d’un gradient de couleur allant de noir pour une expression nulle à rouge pour une expression maximale (intensité exprimée en log). Chez M. truncatula aucun gène ABI3-like n’a été mis en évidence et la sonde de la puce liée au gène ABI4 ne permet pas de suivre son expression. L’absence de données d’expression pour ces deux gènes est donc remplacée par un carré gris. En revanche, deux gènes codant pour VAL2 ont été identifiés chez M. truncatula et C. australe, le deuxième a été nommé VAL2-like dans cette figure. B) Pour chacun de ces gènes, les ratios d’intensité entre stade mature (CaB et ABS) et immature (CaG et 14 DAF) des graines de C. australe et M. truncatula A17 sont figurés dans les deux premières colonnes. Les autres colonnes représentent la différence d’expression entre les graines mutantes Mtabi3-2 et sauvages R108 à un stade donné (24 DAF pour la troisième colonne et 40 DAF pour la quatrième colonne). La différence d’expression est visualisée sous la forme d’un gradient de couleur allant de vert pour une sous expression chez la graine mature par rapport à la graine immature ou chez la graine mutante par rapport à la graine sauvage ; rouge pour une sur expression et noir si l’expression est comparable entre les deux conditions.
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truncatula et de C. australe (Figure 3.7B). L’ACP confirme d’une part que le développement des graines Mtabi3-2 semble retardé comparé à celui des graines R108. D’autre part, alors que les stades immatures et mi-matures de C. australe sont très proches entre eux, ils sont très différents du stade mature.
Sur la base de l’ACP, il est difficile d’associer chaque stade de développement des graines de C. australe à un stade de développement de M. truncatula. Cependant, il est intéressant de constater que l’évolution entre les stades mi-mature et mature de C. australe suit la même direction qu’une graine de M. truncatula en germination.