Analyse fonctionnelle des homologues

CaABI3 et CaABI3-like : comparaison avec

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Approche et principaux résultats

Dans le chapitre III, nous avons montré que l’expression du gène ABI3 est réprimée chez les graines de C. australe en fin de développement, alors qu’il reste fortement exprimé tout au long de la maturation des graines de M. truncatula. L’objectif de ce chapitre est de déterminer si les homologues identifiés chez l’espèce récalcitrante ont les mêmes fonctions que ceux identifiés chez M. truncatula et A. thaliana. Deux approches ont été mises en place pour tester la fonctionnalité de CaABI3 : la comparaison des cibles potentielles activées par expression ectopique de CaABI3 et de MtABI3 dans des racines de M. truncatula et la complémentation du mutant abi3-5 d’A. thaliana. Les résultats majeurs mis en évidence peuvent être résumés en quatre points :

Deux gènes très similaires entre eux et avec MtABI3 ont été clonés chez C. australe : CaABI3 et CaABI3-like.

Les gènes sur-exprimés par CaABI3 et MtABI3 dans un système d'expression ectopique sont très divergents. Alors que la sur-expression de MtABI3 dans les racines de M. truncatula active l’expression de 90 % des 109 cibles ABI3 de M. truncatula identifiées dans le chapitre précédent, la sur-expression de CaABI3 dans les mêmes conditions n’active l’expression que de 17 % d’entre elles.

Contrairement à ce qui est observé pour CaABI3, la sur-expression de CaABI3-like dans les racines de M. truncatula active la majorité des 109 cibles ABI3 de M. truncatula. Le profil d’expression obtenu est semblable à celui observé en sur-exprimant MtABI3 dans les mêmes conditions.

CaABI3 ne complémente pas le mutant abi3-5. Les graines mutantes transformées par CaABI3 restent vertes à maturité, ne sont pas dormantes et sont insensibles à l’ABA. Le phénotype sauvage (dégradation de la chlorophylle, sensibilité à l’ABA, et dormance) est restauré dans les graines mutantes complémentées par AtABI3.

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A1

B1

B2 B3

B3

A2

Figure 4.1. Alignement des séquences protéiques de MtABI3 (génotype R108), CaABI3 et CaABI3-like.

Les séquences génomiques et les ADNc des homologues ABI3 chez M. truncatula et C. australe ont été clonés par PCR dégénérée. Les séquences protéiques intégrales ont été déduites de ces clonages et alignées par le logiciel MultAlin à l’aide de la matrice Blosum 62. Les domaines conservés A1, B1, B2 et B3 ont été positionnés. Un cinquième domaine conservé a été ajouté en pointillé. Ce domaine n’est pas décrit dans la littérature excepté chez le pois où un deuxième domaine acide (A2) a été mis en évidence (Gagete et al., 2009). Chez le mutant abi3-7, l’alanine située au niveau de la flèche orange (position 531 sur cet alignement) est substituée par une thréonine. Chez le mutant abi3-1, l’aspartate situé au niveau de la flèche bleue (position 662 sur cet alignement) est substitué par une asparagine (Bies-Ethève et al., 1999).

Tableau 4.1. Pourcentage de similarité entre les séquences protéiques de MtABI3, AtABI3, CaABI3 et CaABI3-like.

Les pourcentages ont été déterminés avec le programme MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) (Campanella et al., 2003) en utilisant la matrice Blosum50.

similarité en AA (%) ^Protéine

entière

Domaine

A1

Domaine

B1

Domaine

B2

Domaine

B3

CaABI3 / CaABI3-like 84,7 95,7 97 100 97,5

MtABI3 / CaABI3 74,3 76,8 94 96,4 98,3

MtABI3 / CaABI3-like 75,3 75 94 96,4 97,5

AtABI3 / CaABI3 61,5 80,8 91 89,3 97,5

AtABI3 / CaABI3-like 63,2 76,9 91 89,3 98,3

AtABI3 / MtABI3 59,8 80,4 82,5 92,9 97,5

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1-Clonage des homologues du gène ABI3 chez C. australe

Dans la base de données Genbank, les séquences (complètes ou partielles) du gène ABI3 de 18 espèces sont disponibles mais ce gène n’avait pas encore été séquencé chez M. truncatula au moment de l’initiation de ces travaux. Ces séquences ainsi que l’EST disponible chez M. truncatula (TC193312 MtGI11) ont été alignés pour dessiner des couples d’amorces dans les régions les plus conservées. Par PCR dégénérée, une portion des homologues ABI3 chez M. truncatula et C. australe a ainsi été clonée à partir d’ADN génomique. Dans un deuxième temps, la séquence complète a été obtenue par PCR inverse à partir de cette région initiale. Alors qu’un gène de 3 459 pb a été cloné chez M. truncatula A17 et R108, deux gènes présentant une forte similarité ont été clonés chez C. australe : CaABI3 (3 047 pb) et CaABI3-like (3 074 pb). Les CDS correspondant ont également été clonés à partir d’ARN de graines afin de déterminer la taille et la position d’éventuels introns. En effet, cinq introns ont été identifiés au niveau du domaine B3 chez plusieurs espèces comme A. thaliana (TAIR10), le pois (Gagete et al., 2009), la tomate (Gao et al., 2013). Ces cinq introns sont également présents chez M. truncatula et C. australe. Les CDS correspondant ont une taille de 2 313 pb (MtABI3), 2 265 pb (CaABI3) et 2 283 pb (CaABI3-like).

Les CDS de CaABI3, CaABI3-like et de MtABI3 ont été traduit in silico pour quantifier la similarité entre ces trois protéines. Une très grande similarité est visible entre ces trois séquences en alignant les séquences protéiques déduites à l’aide du logiciel MultAlin, notamment au niveau des quatre domaines conservés (Figure 4.1). Un cinquième domaine très conservé est mis en évidence entre les positions 186 et 211. Il correspond à un deuxième domaine acide (A2) mis en évidence par Gagete et al. (2009) chez le pois. Le pourcentage de similarité global (séquence protéique entière) entre les deux protéines CaABI3 et CaABI3-like est de 84,7 % (Tableau 4.1). Il s’élève même respectivement à 95,7 %, 97 %, 100 % et 97,5 % en considérant uniquement les domaines conservés A1, B1, B2 et B3. Il apparait donc clairement que les gènes CaABI3 et CaABI3-like codent tous les deux pour un facteur ABI3. Le pourcentage de similarité global avec MtABI3 est semblable pour CaABI3 et CaABI3-like, respectivement 74,3 % et 75,3 %. Il en est de même en considérant uniquement les domaines conservés : respectivement 76,8 % et 75 % pour A1 ; 94 % pour B1 ; 96,4 % pour B2 ; 98,3 % et 97,5 % pour B3 (Tableau 4.1). Les trois domaines basiques (B1, B2 et B3) sont extrêmement bien conservés entre les deux espèces. Le degré de conservation est moindre pour le domaine acide A1, notamment à cause d’une délétion du motif TSTTTTTTS chez C. australe (Figure 4.1). La similarité des séquences CaABI3 et CaABI3-like avec AtABI3 est globalement inférieure qu’avec MtABI3 (Annexe 6) mais la conservation au niveau des quatre domaines reste très élevée, notamment pour le domaine B3 (Tableau 4.1). Il est intéressant de noter que la similarité AtABI3/CaABI3 (61,5 %) ou AtABI3/CaABI3-like (63,2 %) est globalement plus importante que la similarité AtABI3/MtABI3 (59,8 %). Par ailleurs, les acides aminés substitués dans les mutants abi3-1 (D580N ; phénotype faible) et abi3-7 (D580N et A458T ; phénotype fort) (Bies-Ethève et al., 1999) sont conservés chez MtABI3, CaABI3 et CaABI3-like (Figure 4.1). Ces résultats suggèrent que la structure primaire des protéines CaABI3 et CaABI3-like est assez proche de celle de MtABI3 et AtABI3. Ces protéines ont-elles les mêmes fonctions ?

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B

A

Figure 4.2. Profil d’expression des gènes cibles de MtABI3 en réponse à la sur-expression de CaABI3g, de

MtABI3g, de MtABI3_CDS dans les racines R108 et de CaABI3-like et MtABI3_CDS dans les racines de Mtabi3-2. Les 55 gènes cibles de MtABI3 identifiés dans le transcriptome de C. australe (A) et les 54 gènes cibles de MtABI3 non identifiés sur la puce Ca (B) ont été classés par clustering hiérarchique (HCL) à partir des valeurs de ratios d’intensité entre racines R108 ou Mtabi3-2 transformées par ABI3 (CaABI3g, CaABI3-like, MtABI3_CDS, MtABI3g) et racines R108 ou Mtabi3-2

transformées par le vecteur vide. La différence d’expression est visualisée sous la forme d’un gradient de couleur allant de vert pour une sous-expression dans la racine transformée par ABI3 par rapport à la racine transformée par le vecteur vide ; rouge pour une sur-expression et noir si l’expression est comparable entre les deux échantillons. N.A. = non annoté.

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