Commentaires méthodologiques 87

Certains apports méthodologiques manquaient à cette thèse et qui aurait complété notre portrait de la communauté de protistes. Tout d'abord, la mesure de la turbidité de l'eau par un disque de Secchi aurait rajouté un paramètre environnemental dans chaque chapitre, pour savoir si la succession des protistes était influencée par la turbidité de l'eau. Cette méthode peut être combinée à la mesure des radiations disponibles pour la photosynthèse (PAR). Celle-ci se fait entre 400 et 700 nm et permet de quantifier la lumière que la communauté reçoit pour la photosynthèse. La turbidité de l’eau influence potentiellement la répartition de la communauté entre la ferme et l’extérieur de la ferme de moules : en effet, l’excrétion des fèces par les moules peut augmenter la turbidité de l’eau.

Ensuite un échantillonnage sur toute l’année (ou à partir du mois d’avril) peut nous apporter davantage d’informations. En effet, les efflorescences de diatomées dont les moules peuvent se nourrir sont printanières. La signature en acides gras aurait peut être changé à ce moment-là. Également une efflorescence aurait pu changer la dynamique des interactions proies-prédateurs de la communauté. L’interaction entre les petites cellules photosynthétiques et les dinoflagellés aurait était moindre, ou remplacer par un autre couple proie- prédateur entre les diatomées et autres protistes qui aurait changé la dynamique de la communauté microbienne eucaryote. De même la profondeur de séquençage peut être augmenté en utilisant la méthode Illumina et non pas du pyroséquençage. La couverture de séquençage est dix fois plus élevé par la méthode Illumina.

A ce propos, il pourrait être pertinent de reconstruire le réseau trophique de la lagune du phytoplancton jusqu’aux moules. Les interactions entre organismes ont été simplifiées dans cette thèse. Il existe certainement des interactions spécifiques se répercutant sur tout le réseau trophique et que nous n’avons pas détecté dans cette thèse. Cela peut se faire sur le terrain en déterminant des contenus stomachaux des moules sachant que la dégradation des organismes ne pourrait pas se faire en détail étant donné la digestion. Il est aussi possible de prendre les espèces deux à deux au laboratoire et de déterminer qu’elle est le type d’interaction : prédation, compétion…

De plus sur le chapitre 4 le calcul de two-way ANOVA montre qu’il y a peut être un effet au niveau de l’espèce selectionné par les moules. Dans notre cas, il s’agirait de Parastrombidinopsis et de Strombidinium tous deux des ciliés qui ont une abondance relative supérieures à 100 sequences. Leur abondance est siginificativement différente entre la ferme et le contrôle. Il est possible que les moules sélectionnent ce qu’elles mangent et ce n’est pas seulement une filtration passive. Cependant la méthodologie employée ne permet de répondre à cette question. Il aurait été intéressant de mettre des moules en bassins et de leur donner spécifiquement

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chacune de ces espèces. Au moyen de comptage de cellules la sélection des moules auraient pu être mise en avant. Les différences signifcatives des autres genres entre la ferme et les sites contrôles sont par contre à prendre avec précaution car les abondances relatives sont trop faibles. Il peut s’agir d’un faux positif en statistiques.

5.2.2 Biais méthodologiques

Lors de l’échantillonnage, nous utilisons une filtration de l’eau avec la séparation de la communauté sur un filtre ayant des pores de 3 µm – la grande fraction - et un autre avec des pores de 0,2 µm de diamètre. Cela pourrait avoir comme conséquence d’enrichir le filtre de 3 µm avec des petites cellules. Cependant nous avons dans le chapitre 2 fait une corrélation entre les picozoa (se trouvant sur le filtre de 3 µm) avec les cellules picoeucaryotes (se trouvant sur le filtre de 0,2 µm). Si un enrichissment des petites cellules sur le filtre de la grande fraction s’était produit la corrélation aurait été positive. Cela n’a pas été le cas dans le résultat. Dans le chapitre 4, la communauté n’est pas reconstruite le séquençage des deux fractions est indépendant. Dans ce cas, il faut simplement prendre en compte que dans la petite fraction nous pouvons retrouvé l’ARN de grandes cellules et prendre en compte cette information dans les conclusions de l’étude.

Dans le chapitre 2, au laboratoire après traitement des échantillons, la communauté a été reconstruite en vu du séquençage en ce basant sur les données de la cytométrie de flux. Dans ce cas la communauté de phototrophes bien représenté dans la cytométrie est certainement bien réaliste dans le séquençage. Le biais se fait peut être sur la communauté d’hétérotrophes que nous avons peut-être sous estimé en suivant le nombre de cellules nanoplanctonique phototrophes retrouvés en cytométrie de flux. Cependant dans le groupe des dinoflagellés, il y a beaucoup d’hétérotrophes que nous ne pouvons identifier mais bien présent. L’information taxonomique refléte alors mieux la réalité de la diversité de la lagune. Aussi, il est connu que les lagunes ayant de faible concentration en nutriments sont « dominés » par les petites cellules photosynthétiques. Dans ce cas le chapitre 2 malgé le biais méthodologique va dans ce sens. Un suivi plus simple peut également être mis en place par un comptage des cellules. Une des solutions à ce biais est de dénombrer les cellules hétérotrophes en cytométrie de flux. Le comptage des cellules hétérotrophes par cytométrie se fait grâce au Lysotracker green qui et un fluorochrome s’attachant aux organelles acidiques. En parallèle au comptage total des cellules et des cellules phtosythétiques, il est possible de discriminer les cellules hétérotrophes. Lors de l’identification taxonomique à laquelle on rattache l’identification fonctionnelle, il faut savoir que certains genres n’ont pas d’assignation fonctionnelle de part le manque de connaissance spécifique. Il y aura tout de même une inconnue persitente à ce possible biais. Dans le chapitre 4 à court terme, nous voyons en début de l’échantillonnage une grande proportion d’hétérotrophes comme les cercozoa. Lorsque l’on prend seulement le début et la fin d’échantillonnage, nous observons une alternance entre hétérotrophes et phototrophes. Cela vient confirmer les résultats du chapitre 2, même si un bais existe

sur les hétérotrophes, l’alternance entre cellules photosythétiques et cellules hétérotrophes est bien réelle car retrouvée dans deux études indépendantes.

L'utilisation de la PCR et du séquençage engendre des biais lors de l'analyse des échantillons. La PCR va amplifier davantage les organismes ayant un plus grand nombre de copies du gène du 18S, dont l'ADN est en plus grande quantité. La polymérase peut aussi amplifier davantage les organismes hétérotrophes dû a une fixation variable des amorces sur les brins d'ADN. C’est peut être pour cela que nous retrouvons une grande quantité de dinoflagellés dans le chapitre 2. Dans le chapitre 4, où nous utilisons l’ARN, le biais se fait peut être sur les Cercozoa et non plus les dinoflagellés pour la même raison. Cependant malgré ce bais méthodologique les grandes conclusions de chaque chapitre sont maintenues. Le signal biologique est très fort et détecté entre les différents chapitres par la cytométrie en flux, les variables environnementales et l’utilisation des acides gras en tant que signature lipidiques pour les microorganismes.

Également, le séquençage peut créer des chimères. La polymérase assemble deux brins d'ADN précédemment indépendants l'un de l'autre. Un algorithme est utilisé lors du nettoyage des séquences pour les éliminer; cependant, il se peut que certaines ne soient pas détectées. L’assignation taxonomique peut être faussée, une séquence est assignée à un genre pour les premiers nucléotides alors qu’elle correspond à un autre genre pour les derniers nucléotides. Si le véritable genre est retrouvé en grand nombre dans le jeu de données, la présence d’une chimère ne changera pas les conclusions. Ou bien un genre avec un très faible nombre de séquences est créer dans ce cas là il faut considérer cette information avec attention: l’alignement et l’élimination des séquences présentes une seule fois – singletons – effectué après la détections des chimères augmente la confiance dans le jeu de données.

Finalement, lors de l'analyse des séquences nous avons ré-échantillonné pour avoir le même nombre de séquences dans tous les échantillons. Ainsi nous pouvions les comparer entre eux deux à deux sur une base de l'abondance relative. Cependant nous perdons de l’information, environ 50%. Les mesures de diversité β qui prennent en compte la taille des échantillons existent, mais les cellules eucaryotes unicellulaires peuvent posséder une ou plusieurs copie(s) du gène 18S. Il est possible que cela entraîne un biais encore plus important dans nos analyses en surestimant le nombre de séquences qui nous sert de proxy d’abondance. Le nombre de copies du gène 18S est extrêmement mal connu pour chacun des genres taxonomiques vus dans cette thèse.

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