Chronologie de la réponse immunitaire au sein du plexus myentérique

La mort des neurones DAergiques en périphérie est controversée chez l’humain. En effet, il n’y a pas consensus parmi les diverses équipes de recherche ayant investigué ce sujet. De plus, leurs résultats sont difficiles à comparer puisqu’elles ont utilisé des techniques différentes dans leurs études. Singaram et coll. (1995) ont mesuré une diminution du nombre de neurones DAergiques des plexus myentérique et sous-muqueux, ainsi qu’une diminution de la concentration en DA, dans des biopsies de colon de patients111_{. Quant à Lebouvier et coll. (2010) et Corbillé et coll. (2014), ils n’ont}

observé aucune différence dans le nombre de neurones positifs à la TH du plexus sous-muqueux dans des biopsies de colon de patients108,189_.

Un ensemble croissant d’études appuie le fait que le système immunitaire soit activé dans l’intestin de patients parkinsoniens. Cela avait d’ailleurs été rapporté en 1995 par Singaram et coll. qui observaient la présence de cellules inflammatoires dans le SNE de biopsies de colon de patients111_.

D’autres études ont par la suite montré une augmentation de l’expression de certaines cytokines pro- inflammatoires telles que le TNF-α, l’IFN-γ, l’IL-6 et l’IL-1β chez les patients parkinsoniens54,190_{, en}

plus d’une augmentation de marqueurs de cellules gliales54_{. Finalement, un article de Forsyth et coll.}

(2011) a décrit une augmentation de la perméabilité de l’épithélium intestinale chez les patients parkinsoniens. Cette hyperperméabilité augmente l’exposition du SNE, ainsi que du système immunitaire, aux bactéries intestinales ainsi qu’aux endotoxines contenues dans la lumière de l’intestin telles qu’Escherichia coli 113_{. En plus, une étude récente a fourni des évidences montrant}

des altérations de la morphologie de la barrière épithéliale intestinale chez les patients parkinsoniens191_.

Ces éléments montrent la pertinence d’étudier la réponse immunitaire au sein du plexus myentérique, dans un modèle parkinsonien, dans l’optique du rôle du tractus gastro-intestinal dans l’initiation et/ou la progression de la MP.

I.1.1 But

Comprendre les évènements immunitaires prenant place dans le plexus myentérique suite aux injections de MPTP afin de les caractériser et d’établir leur chronologie dans le temps.

I.1.2 Hypothèse

1. Le MPTP active directement les cellules du système immunitaire inné puis celles-ci induisent des dommages chez les neurones DAergiques. Cette activation précèderait les dysfonctions neuronales, et se passerait donc à des temps précoces.

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I.1.3 Matériel et méthodes

Dans le cadre de notre étude, nous avons utilisé trois lignées de souris transgéniques :

Souris transgéniques cis-NF-κBeGFP

Cette souris knock-in exprime le gène enhanced green fluorescent protein (eGFP) sous le contrôle transcriptionnel des éléments cis du facteur de transcription NF-ĸB (souris cis-NF-ĸBeGFP₎192_{. Les}

souris ont été obtenues du laboratoire du Dr Christian Jobin (Floride, États-Unis).

Souris transgéniques lysMeGFP

Cette souris knock-in exprime le gène eGFP sous le contrôle transcriptionnel du gène associé au lysozyme M (souris lysMeGFP₎193_{. Les souris ont été obtenues du laboratoire du Dr Steve Lacroix}

(Québec).

Souris transgéniques CX3CR1GFP

Cette souris knock-in exprime le gène GFP sous le contrôle transcriptionnel du gène associé au récepteur à la fractalkine (CX3CR1) (souris CX3CR1GFP)194. Les souris ont été achetées chez le

laboratoire Jackson (Maine, États-Unis).

Les animaux ont été mis en cage et nourris ad libitum au Centre de recherche du CHU de Québec. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité Universitaire de protection des animaux de l’Université Laval et conduites en accord avec le guide canadien du Conseil canadien de protection des animaux.

Traitements expérimentaux et préparation des échantillons

Les souris mâles ont été injectées par voie intra-péritonéale avec le traitement souhaité : 4 injections de 8 mg MPTP/kg de poids corporel ou 20 mg MPTP/kg de poids corporel (dilué dans de la saline 0,9%) espacées de 2 heures, 1 injection de 10 mg LPS/kg de poids corporel113,195 _{(dilué dans de la}

saline 0,9%) ou le même nombre d’injection de saline 0,9% que le traitement actif. Les souris ont été euthanasiées par translocation cervicale suite à une injection de xylazine/kétamine à différents temps tels qu’illustrés sur les figures 20-22. L’intestin a été récupéré, puis une partie de l’iléon a été mis de côté alors que le reste de l’intestin a été mise dans une solution de paraformaldéhyde (PFA) 4% pour 24 heures avant d’être remplacée par un tampon phosphate salin (PBS) pour sa conservation. Le morceau d’iléon a été micro-disséqué afin d’enlever la couche de microvillosités, puis incubé avec du DRAQ5™ 5 µM afin de marquer les noyaux cellulaires (Abcam, États-Unis).

Imagerie ex vivo de l’iléon

Les échantillons d’iléon, incubés dans du milieu de culture (Dulbecco’s modified eagle medium ; DMEM, avec 10% de sérum fœtal bovin), dans une boîte de Pétri, à l’intérieur d’une boîte de conditionnement avec un circuit d’eau et de CO2 à 37°C, ont été imagés avec un microscope à

balayage laser confocal (Olympus IX81-FV1000 ; Ontario, Canada). Les images confocales ont été acquises avec un objectif 40x par un balayage laser non-séquentiel et une séparation spectrale optimale grâce à des filtres multispectraux.

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Traitements expérimentaux, mesures de phagocytose et préparation des échantillons

Trois souris CX3CR1GFP par groupe ont été injectées avec de la saline ou du MPTP (même dosage

que pour le dynamisme cellulaire. Les souris ont été injectées dans la veine de la queue avec du dextran TexasRed™ 2,5% 1 heure avant d’être sacrifiées, 5 jours après le traitement. Elles ont par la suite été perfusées avec de la PFA 4%. Des échantillons d’iléons ont été micro-disséqués afin d’isoler le plexus myentérique. Ces sections ont été marquées avec du DAPI afin de marquer les noyaux cellulaires (Life techonologies, États-Unis) puis montées sur lame.

Imagerie de l’activité de phagocytose

Les échantillons d’iléon ont été imagés avec un microscope à balayage laser confocal (Olympus IX81-FV1000 ; Ontario, Canada). Les images confocales ont été acquises par un balayage séquentiel avec un objectif 40x à immersion. Les images ont été analysées avec le logiciel Imaris™ (Bitplane, Zurich, Suisse) où l’intensité en GFP ou en TexasRed™ a été mesurée à l’intérieur du volume de cellules CX3CR1GFP.

Mesure des trajectoires des cellules

La mesure des trajectoires des cellules telles que présentées dans les figures 20C, 21F et 22C a été faite avec le logiciel ImageJ en utilisant l’extension MTrackJ.

Analyses statistiques

Lorsque nécessaire, un test Mann-Whitney a été fait avec le logiciel GraphPad Prism 5.0d (GraphPad Software Inc., Ca, USA). Une valeur de p < 0,05 était requise pour que le résultat soit considéré comme statistiquement significatif.

I.1.4 Résultats expérimentaux

Cette expérimentation a permis d’établir une chronologie des évènements cellulaires prenant place dans le plexus myentérique de l’iléon de souris transgéniques suite à un traitement MPTP. Dans un premier temps, nous avons voulu étudier la voie NF-κB de par son rôle dans la réponse immunitaire innée menant, entre autres, à la sécrétion d’une cytokine pro-inflammatoire, l’IL-1β. L’activation de cette voie peut être observée dans le tissu 24 heures (h) après la première injection de MPTP (Fig. 20A), alors qu’aucun signal n’est observé chez la souris sacrifiée après 6h ni chez la souris traitée avec de la saline (données non-montrées). Les cellules GFP positives correspondent morphologiquement à des macrophages, avec un pic d’intensité de GFP au temps 48h. Après 96h, le signal est encore présent chez ces cellules (Fig. 20A). De plus, nous observons l’activation des cellules endothéliales avec une forte intensité de celles-ci à 48h. Chez les souris traitées avec la lipopolysaccharide (LPS), une endotoxine bactérienne connue pour induire une réponse inflammatoire, l’activation de la voie NF-κB semble être plus rapide, avec déjà un signal important au temps 24h (Fig. 20B). Cette dernière induit elle aussi une activation des cellules endothéliales en plus de celle des macrophages. À partir de 48h, une diminution de l’intensité de GFP est visible dans le tissu. Lors d’un traitement MPTP plus agressif, nous pouvons observer une infiltration massive de neutrophiles dans le plexus myentérique à 24h (Fig.20C).

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Figure 20 - Réponse NF-κB dans le temps chez des souris cis-NF-κBeGFP

A. Réponse NF-κB dans le temps suite à un traitement MPTP dosé à 8 mg/kg. B. Réponse NF-κB dans le temps suite à un traitement

LPS. C. Infiltration de neutrophiles dans le plexus myentérique chez une souris traitée au MPTP dose 20 mg/kg et sacrifiée à 24h. Les neutrophiles se déplacent rapidement dans le tissu comme le montre 4 exemples de déplacement. Ces cellules sont reconnaissables de par la forme de leur noyau polylobé.

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Ces neutrophiles sont faiblement positifs en GFP. Par ailleurs, avec cette dose de MPTP, les cellules endothéliales sont activées à un niveau similaire à ce que nous pouvons observer chez les souris NF-κB traitées avec la LPS et le MPTP faible dose.

Par la suite, nous avons utilisé des souris CX3CR1GFP dans le but d’observer le rôle des

macrophages résidents dans la réponse immunitaire du plexus myentérique. Dans une première expérience sur une souris traitée au MPTP et sacrifiée 5 jours plus tard (temps 120h), nous avons constaté que les macrophages résidents ne sont pas mobiles dans le tissu en réponse à la neurotoxine. Cependant, des noyaux, marqués avec le DRAQ5™, de cellules GFP négatives se déplaçaient rapidement à travers le tissu (Fig.21F). Un protocole de souris injectées avec de la LPS ou de la saline a par la suite confirmé la première observation selon laquelle les macrophages patrouillent activement leur environnement de manière très dynamique, leurs prolongements étant fortement mobiles, mais ne se déplacent pas dans le tissu (Fig.21ABC). De plus, une étude sur l’intensité de la GFP des macrophages résidents entre des souris traitées au MPTP ou à la saline et sacrifiées au temps 120h a été faite (Fig.21D). Nous observons une diminution de cette intensité chez les macrophages traités avec le MPTP. Finalement, un essai pour mesurer l’activité phagocytaire des macrophages résidents a été réalisé avec du dextran TexasRed™(Fig.21E). Nous observons une diminution de cette activité avec un traitement MPTP en comparaison à un traitement avec de la saline.

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Figure 21 - Étude du dynamisme cellulaire chez des souris CX3CR1-GFP

A. Réponse des macrophages CX3CR1GFP positifs dans le

temps suite à un traitement LPS. Échelle : 24μm.

B. Réponse des macrophages CX3CR1GFP positifs dans le

temps suite à un traitement de saline. Échelle : 24μM.

C. Images illustrant un macrophage et son dynamisme

(traitement LPS, sacrifice après 24h) tel que montré en A. en haut, ou avec une superposition de couleurs correspondant à des temps différents en bas. Échelle : 18μm. D. Mesure de l’intensité en GFP de macrophages CX3CR1GFP en fonction d’un traitement de saline ou MPTP dose 8

mg/kg. Test Mann-Whitney, p<0,0001. E. Mesure de l’intensité en TexasRed™ de macrophages CX3CR1GFP en fonction d’un

traitement de saline ou MPTP dose 8 mg/kg. Test Mann-Whitney, p<0,0001. F. Imagerie en microscopie confocale d’une souris traitée au MPTP dose 8 mg/kg et sacrifiée au temps 120h montrant, à gauche, la présence de deux cellules CX3CR1GFP négatives

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Enfin, nous avons utilisé la souris lysMeGFP _{pour étudier la participation immunitaire des monocytes}

circulants pouvant infiltrer le plexus myentérique et, potentiellement, valider si ce type cellulaire

pourrait correspondre aux cellules CX3CR1GFP négatives observées précédemment. Nous observons

alors la présence de cellules lysMeGFP _{positives dans le tissu dès 6 heures après la première injection}

de MPTP (Fig. 22A). De plus, ces cellules sont, pour certaines, sous forme amiboïde et se déplacent activement dans le tissu (Fig.22C). Ces cellules activées sont aussi présentes aux temps 24h et 48h, cependant le nombre de cellules se ramifiant, perdant ainsi leur phénotype actif, augmente dans le

temps. Ainsi, à 72h, la majorité des cellules lysMGFP+ _{sont ramifiées. Chez les souris traitées avec la}

saline, nous observions une grande quantité de macrophages ramifiés, mais pas de cellules amiboïdes. Fig.22B).

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Figure 22 - Étude du dynamisme cellulaire chez la souris lysMeGFP

A. Réponse des cellules lysMeGFP _{positives dans le temps suite à un traitement MPTP. Échelle : 24 μm. B. Réponse des cellules}

lysMeGFP _{positives dans le temps suite à un traitement de saline. Échelle : 24 μm C. Imagerie en microscopie confocale d’une souris}

traitée au MPTP et sacrifiée au temps 6h telle que montrée en A. montrant, à gauche, la présence de deux cellules lysMeGFP _positives

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