Étude ex vivo avec l’APP +

II.4.1 But

Investiguer la capacité des cellules immunitaires à transporter le MPP+ _{en imageant son}

analogue fluorescent l’APP+ _{sur des tissusvivants d’iléon.}

II.4.2 Hypothèses

1. Les cellules immunitaires sont capables de transporter l’APP+ _;

2. L’APP+ _{peut servir de marqueur de la capacité de transport du MPP}+_.

Figure 28 – Étude in vitro de la viabilité cellulaire et de la production de nitrite suite à un conditionnement de cellules THP-1 et SH-SY5Y à différents traitements de MPP+

Légende : La table sous les graphiques illustre les différents traitements utilisés pour chaque colonne, la première ligne étant le MPP+ _{seul, la deuxième ligne étant le surnageant de}

l’autre monoculture seul et la troisième ligne étant pour le surnageant de cellules traitées avec le MPP+_{; barre d’erreur :}

SEM; n=3; Two-way ANOVA; *p < 0,05 et ***p < 0,001 pour le contrôle négatif, ###_{p < 0,001 pour le traitement au MPP}+ _seul.

43

II.4.3 Matériel et méthodes

Traitements expérimentaux

Une souris CX3CR1GFP a été sacrifiée puis son iléon récolté immédiatement pour être micro-

disséqué. La couche de microvillosité a été enlevée, et l’échantillon incubé avec 500 nM de APP+ _{et 5}

μM de DRAQ5™ dans du milieu de culture.

Imagerie

L’échantillon d’iléon, incubé dans du milieu de culture (DMEM avec 10% de sérum fœtal bovin), dans

une boîte de Pétri, à l’intérieur d’une boîte de conditionnement avec un circuit d’eau et de CO2 à

37°C, ont été imagés avec un microscope à balayage laser confocal (Olympus IX81-FV1000 ; Ontario, Canada). Les images confocales ont été acquises par un balayage laser séquentiel avec un objectif 40x.

II.4.4 Résultats expérimentaux

Tel qu’attendu, l’APP+ _{marque ce qui semble être les neurones DAergiques et leurs}

prolongements à l’intérieur du plexus myentérique de manière très similaire à ce que nous pouvons observer en présence d’un marquage TH en immunofluorescence (Fig. 33). Cependant, il n’est pas

possible de conclure quant à la colocalisation de l’APP+ _{et des macrophages CX3CR1}GFP _positifs

présents dans les différentes images présentées. En effet, l’APP+ _{émet une fluorescence dans le}

bleu-vert trop près de celle de la GFP, il est donc fort difficile de faire la différence entre les deux

signaux. De plus, l’intensité de l’APP+ _{dans les fibres neuronales était possiblement beaucoup plus}

importante que dans les cellules immunitaires d’où un problème à détecter ce signal durant l’imageri

DRAQ5™ $ $ % % & &

Figure 29 - Étude ex vivo de la capacité des neurones et des macrophages résidents à capter l’APP+

45

Discussion

L’un des objectifs de mon projet de maîtrise était de comprendre le dynamisme de l’inflammation dans la dégénérescence parkinsonienne dans un contexte où le rôle de la réponse immunitaire est incompris dans le développement ou la progression de la MP. Mes résultats démontrent que le système immunitaire inné est activé de manière très précoce dans le plexus myentérique suivant les injections de MPTP. En effet, la voie NF-ĸB est activée dès 24 heures après la première injection dans ce tissu. Au même temps, des cellules infiltrantes telles que des monocytes sont présentes dans le tissu. Elles sont sous forme amiboïde et perdent leur phénotype actif dans le temps en se ramifiant. Quant aux macrophages résidents, ils patrouillent de manière active leur microenvironnement sans se déplacer dans le tissu, mais semblent se polariser vers un phénotype pro-inflammatoire de type M1. Ce dernier résultat a été obtenu avec la comparaison de l’intensité en GFP des macrophages CX3CR1GFP positifs du plexus myentérique.

Notre étude a permis de caractériser la chronologie des évènements cellulaires se produisant dans le plexus myentérique suite au traitement avec la neurotoxine. Cette précocité immunitaire est très intéressante dans le contexte de la maladie de Parkinson puisque, comme plusieurs pathologies où une inflammation chronique est présente, il est difficile de savoir si celle-ci est une cause ou une conséquence de la maladie. Ainsi, une activation du système immunitaire pourrait se faire suite à l’altération des neurones, comme les neurones DAergiques, ou encore cette activation aurait lieu en premier par un agent chimique ou pathogène puis causerait des dégâts chez les neurones. Aussi, puisque cette inflammation est chronique, il ne faut pas perdre de vue l’activation en boucle de ce système : les cellules immunitaires causent des altérations cellulaires de par les différentes molécules pro-inflammatoire qu’elles produisent, ce qui mène au recrutement d’autres cellules sur le site de l’inflammation pour nettoyer les débris. Dans notre modèle d’inflammation intestinale induite par le MPTP, une altération significative des neurones DAergiques marqués par la TH est visible dès 24h après la première injection, c’est-à-dire au même moment que l’activation de la voie NF-ĸB a été observée. Dans ce contexte, il est ardu de conclure si l’activation du système immunitaire inné a eu lieu avant l’atteinte des neurones DAergiques ou l’inverse. Cependant, des résultats publiés cette année par le laboratoire indiquent, qu’au niveau du SNC, une inflammation serait présente avant l’atteinte significative des neurones positifs pour la TH11_{. En effet, l’activation de la voie NF-ĸB a été}

observée dans le striatum et la SN dès 24h après la première injection de MPTP, alors qu’une diminution significative en TH n’est présente qu’après une période de 10 jours au niveau du striatum11_.

L’étude de l’immuno-phénotype de cellules immunitaires telles que les monocytes/ macrophages/microglies est très complexe et difficile à interpréter. Alors que des chercheurs de renoms avaient créé une nomenclature ressemblant à celle des lymphocytes, ceux-ci sont revenus en arrière récemment en expliquant qu’il s’agissait d’un modèle trop simpliste qui, au final, n’est pas représentatif de ce qui se passe dans l’organisme127,133_{. Effectivement, la dichotomie entre les 2}

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existe une plage de phénotypes variés dont les fonctionnalités peuvent se chevaucher. Cependant, cette nomenclature est un outil nécessaire afin d’étudier l’activation de ces cellules immunitaires en réponse à certaines conditions d’expérimentation et doit être utilisée avec précaution133_{. Dans le}

cadre du protocole sur le dynamisme cellulaire, j’ai montré que les macrophages résidents perdaient l’expression de la GFP avec le traitement MPTP, c’est-à-dire l’expression du récepteur à la fractalkine dont le gène rapporteur est sous son contrôle. Or, l’expression de ce récepteur serait nécessaire aux cellules pro-réparatrices de type M2, et indiquerait une polarisation inverse lorsqu’il y a perte de son expression comme c’est le cas dans mon modèle199_{. Ce résultat concorde avec celui}

obtenu précédemment dans le laboratoire en utilisant un marquage ionized calcium-binding adapter molecule 1 (IBa1) ainsi qu’en utilisant plusieurs anticorps en cytométrie de flux11_{. Dans l’optique de}

caractériser l’activation des macrophages résidents, une expérience avec du dextran TexasRed™ a été faite sur des échantillons d’iléon afin de mesurer l’activité phagocytaire de ces cellules. De manière surprenante, nous avons plutôt observé une diminution de l’intensité en TexasRed™ chez ces cellules, indiquant une perte de l’activité phagocytaire par ces dernières après un traitement MPTP. Ce résultat avait déjà été rapporté dans la littérature par une équipe qui a isolé des monocytes circulants à partir de sang de patients parkinsoniens et effectué une analyse de phagocytose avec des billes fluorescentes200_{. Bien que ce résultat soit sans explication pour l’instant,}

il est fort intéressant de constater la concordance entre celui-ci dans un modèle MPTP et chez les patients parkinsoniens de cette étude en question.

Le modèle MPTP est l’un des plus utilisés dans l’étude de la MP. La dose faible de MPTP entraîne une baisse de 50% de la production de dopamine dans le striatum, mais aucune altération des corps cellulaires des neurones DAergiques se trouvant dans la SN11_{. Ainsi, ce modèle mime un stade}

précoce de la MP, ce qui permet d’étudier les mécanismes de dommages neuronaux dans le cadre de cette maladie, mais aussi d’étudier les évènements immunitaires pouvant être liés à la progression de la pathologie. Cependant, l’une des faiblesses du modèle MPTP/MPP+ _{est le fait que}

celui-ci ne soit pas un modèle chronique de la maladie ; l’action de la neurotoxine étant bien plus rapide que le développement de la MP qui s’étale sur plusieurs années179_.

L’intérêt d’étudier la composante immunitaire de la MP est, d’abord, de caractériser sa réponse afin de comprendre son rôle dans la MP, et ensuite de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour moduler cette réponse indésirable. Plusieurs études portant sur des traitements anti-inflammatoires ont été faites chez les patients parkinsoniens, mais les résultats sont mitigés87,201,202_{. Une des faiblesses de ces traitements est leurs effets systémiques : ils ne sont pas}

assez spécifiques dans leur mécanisme de toxicité. Il importe donc de comprendre les mécanismes précis prenant place dans l’inflammation parkinsonienne afin de trouver des cibles pouvant moduler celle-ci précisément.

Mes résultats in vitro vont dans le sens de mon hypothèse de départ selon laquelle la neurotoxine MPTP, et/ou sa forme toxique le MPP+_{, pourraient activer directement les cellules immunitaires}

47 macrophages murins ainsi que des monocytes humains, étaient capable de capter le traceur fluorescent APP+ _{en plus des neurones DAergiques. Cela indique que ces cellules seraient aussi}

capables de transporter le MPP+ _{et de voir leur activitémodulée par ce dernier. Il s’agit d’un résultat}

très intéressant en lien avec la thématique du laboratoire dans la compréhension du rôle de l’inflammation dans la MP. De plus, aucun autre résultat montrant une activation directe de ces cellules dans le modèle MPTP ne se retrouve dans la littérature. Peu de données sont disponibles concernant le(s) transporteur(s) cellulaire(s) par le(s)quel(s) seraient transporté le MPP+_{. Cependant,}

le DAT est pointé du doigt puisque la neurotoxine affecte préférentiellement les neurones DAergiques. Par contre, les cellules immunitaires n’exprimant pas ce transporteur203_{, il est possible}

que la toxine entre dans les cellules via le SERT puisqu’elles expriment ce dernier204_{. Bien que cette}

question reste sans réponse, mes résultats par cytométrie de flux montrent que le transport de l’APP+

est inhibé lorsque les cellules sont incubées à 4°C. Cette température a la particularité d’inhiber le transport actif cellulaire205_{. Ainsi, ces résultats indiquent que c’est par un transport actif que l’APP}+

entre dans les cellules. Il faudrait bloquer spécifiquement les NET et les SERT afin d’identifier si un de ces transporteurs est impliqué dans le transport de l’APP+_{. Ce même protocole a permis de}

mesurer la cinétique de transport du traceur fluorescent par ces mêmes cellules. De manière intéressante, les cellules ayant le plus de facilité à transporter l’APP+ _{sont les monocytes humains,}

bien devant les neurones DAergiques humains. C’est ce même type cellulaire dont la déplétion partielle chez la souris protège les neurones DAergiques du plexus myentérique lors d’un traitement MPTP. Une étude de la distribution de l’APP+ _{par microscopie confocale a permis d’observer une}

grande colocalisation de ce traceur avec les mitochondries de différents types cellulaires, ainsi qu’une colocalisation entre les mitochondries et le stress oxydatif. Cela concorde avec ce qui est connu du mécanisme de toxicité du MPTP, le MPP+ _{allant effectivement se localiser dans la}

membrane mitochondriale où il inhibe le complexe I de la chaîne respiratoire, créant une crise énergétique au sein de la cellule menant à un stress oxydatif181,182_{. Cependant, l’APP}+ _{n’est pas}

toxique pour les cellules comme le montre des mesures de la survie cellulaire et autres données du laboratoire.

L’étude in vitro de conditionnement de monocytes et neurones DAergiques humains a montré un résultat des plus intéressants : pour qu’il y ait atteinte des neurones DAergiques suite à un traitement au MPP+_{, il doit y avoir la présence de deux composantes: 1) les neurones doivent avoir été en}

contact avec le MPP+ _{2) les neurones doivent avoir été en contact avec le surnageant de cellules}

immunitaires activées par le MPP+_{. Ce phénomène est résumé et illustré par la figure 34 à la page}

suivante. Cette atteinte neuronale est spécifique au traitement MPP+_{, puisque l’activation des cellules}

THP-1 suite aux traitements LPS et MPTP ne suffit pas à induire des dommages aux neurones SH- SY5Y même lorsque jumelés à l’exposition de surnageant de cellules THP-1 activées.

Ainsi, en conditions pathologiques, les neurones DAergiques pourraient produire des ROS et autres molécules suite à un stress ou à une toxine. L’activation des monocytes et des macrophages, quant à elle, serait conséquente à la présence de stress/toxine, mais aussi en réponse aux signaux

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neuronaux. Ce résultat met de l’avant l’importance de la réponse immunitaire dans l’atteinte des neurones DAergiques dans un modèle MPTP.

Évidemment, ces résultats provenant de lignées cellulaires immortalisées, il est important de garder en tête les limitations d’un tel modèle. En effet, bien que de telles lignées permettent une certaine uniformité des résultats au sein de la communauté scientifique, celles-ci ne correspondent pas à la réalité riche et variée des organismes vivants. De plus, le milieu contrôlé dans lequel les expérimentations ont lieu est fortement simplifié par rapport au milieu in vivo. Gillet et coll. (2013) ont d’ailleurs écrit une revue de littérature concernant la complexité de l’utilisation de lignées cellulaires cancéreuses dans les recherches sur le cancer206_.

Après avoir montré l’entrée de l’APP+ _{dans des cellules en culture, nous avons voulu en faire la}

démonstration dans des échantillons d’iléon. Cependant, bien qu’un marquage de neurones du plexus myentérique soit visible, nous n’avons pu obtenir des images montrant la colocalisation du traceur et des macrophages résidants. Une problématique rencontrée est la difficulté de séparer le signal provenant de l’APP+ _{en cyan et de la GFP en vert chez la souris CX3CR1}GFP_{. L’utilisation d’une}

souris transgénique avec un gène rapporteur pour certains types de cellules immunitaires est nécessaire puisque l’APP+ _{ne peut être fixé dans le but de faire des marquages histologiques. Nous}

prévoyons ainsi utiliser des souris transgéniques avec un gène rapporteur autre que la GFP dans un proche avenir.

Le mécanisme d’activation des cellules immunitaires par la neurotoxine n’est pas encore bien compris. Cependant, certains indices pointent vers la voie de l’inflammasome par laquelle les cellules immunitaires vont sécréter l’IL-1β et l’IL-18167_{. En effet, nous savons déjà que la réponse immunitaire}

passe par la voie MyD88/NF-ĸB11,56_{. Or, cette voie est liée à l’activation de l’inflammasome}170_{. Un}

Figure 30 - Schématisation des effets du MPP+ sur les cellules THP-1 et SH-SY5Y

Catherine F. Lavallée et coll. (article en préparation)

a) Le MPP+ _{induit l’accumulation de ROS à l’intérieur du cytoplasme de neurones SH-SY5Y suite à l’inhibition du complexe I de la chaîne}

respiratoire mitochondriale. Il en résultera une production de NO qui sera relâché dans le milieu extracellulaire. b) Le MPP+ induit l’activation des cellules THP-1, lesquelles produiront et relâcheront du NO. c) Les 2 conditions illustrées en a et b doivent être réunies pour que les neurones SH- SY5Y dégénèrent.

49 autre lien intéressant entre la maladie de Parkinson, ainsi que le modèle MPTP, et l’inflammasome est celui entre le stress oxydatif mitochondriale et l’activation de l’inflammasome NRLP3171,172_.

51

Perspective

Les résultats obtenus dans le cadre de mon projet de recherche ont soulevé plusieurs points qui restent sans réponse. Ainsi, il serait intéressant de poursuivre dans ces voies pour de futures recherches au sein du laboratoire.

D’abord, mes résultats ont montré que l’analogue du MPP+ _{emprunte le transport actif de différents}

types cellulaires, mais peu d’informations existent concernant l’identification de ces transporteurs. En effet, alors que chez les neurones DAergiques le transporteur de la dopamine (DAT) est pointé du doigt, nous savons que les cellules immunitaires n’expriment pas celui-ci. Pourrait-il s’agir dans leur cas de (NET) ou de (SERT) ? Cela ne serait pas étonnant puisque l’APP+ _{est connu pour être un}

analogue des neurones catécholaminergiques. La neurotoxine pourrait aussi emprunter un autre transporteur non-identifié.

De plus, des zones sombres restent à éclaircir dans la caractérisation des voies d’activations du système immunitaire inné du modèle MPTP. Les résultats du laboratoire ont précédemment montré l’activation de la voie MyD88 dépendante et de la voie NF-ĸB, une activation consistante avec l’augmentation de la concentration en IL-1β, IL-6 et NO dans le surnageant de cellules en culture. J’ai par la suite montré la chronologie des évènements immunitaires dans le plexus myentérique suite à un traitement MPTP. Ces évènements concordent avec des résultats antécédents du laboratoire. De plus, j’ai démontré la capacité de différents types de cellules immunitaires à capter l’APP+_{, et ainsi le}

MPP+ _{in vitro. Cependant, malgré une hypothèse du rôle de l’inflammasome dans cette activation,}

rien n’est connu de ce côté pour le moment. Il s’agit évidemment d’une piste très intéressante afin de trouver de nouvelles cibles immuno-modulatrices. Aussi, de récentes publications indiquent le lien étroit entre le dysfonctionnement des mitochondries en conditions pathologiques et l’activation de l’inflammasome, plus précisément l’inflammasome NLRP3172,207_.

Bien que mes résultats portent spécifiquement sur la périphérie, nous savons que la réponse immunitaire diffère dans le temps entre le SNE et le SNC. De plus, la déplétion des monocytes pro- inflammatoires n’avaient pas d’effet protecteur dans le SNC alors que c’était le cas dans le SNE, sous-entendant une différence marquée entre les phénomènes immunitaires prenant place dans ces deux tissus distincts11_{. Évidemment, ces divergences mécanistiques sont importantes dans}

l’élaboration de molécules immuno-modulatrices en vue de futurs traitements de la MP.

Une autre voie qui intéresse le laboratoire est l’étude des neurones VIP du plexus myentérique et ce, pour plusieurs raisons. D’abord, Wakabayashi et coll. (1990) ont montré que les corps de Lewy se retrouvent, entre autres, dans les neurones VIP de tissus prélevés chez des patients parkinsoniens99_.

De plus, notre laboratoire a montré le lien fonctionnel étroit entre ce type neuronal et les neurones DAergiques par une étude de colocalisation dans le plexus myentérique. Ainsi, 32% des neurones positifs pour la TH exprimaient aussi le VIP alors que 49% des neurones VIP étaient aussi positifs pour la TH11_{. Finalement, ce neuropeptide possèderait des effets neuro-modulateurs et neuro-}

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l’expression de cette protéine mutée, nous nous retrouverions avec un modèle complexe qui inclut différentes composantes de la MP. Il s’agirait donc de l’α-syn, du VIP et des neurones DAergiques du plexus myentérique. De plus, un modèle utilisant l’α-syn mutée se rapprocherait davantage de la MP de par son aspect chronique avec une accumulation de la protéine dans diverses cellules en comparaison avec le modèle MPTP en usage dans le laboratoire. Il serait ainsi possible d’étudier les caractéristiques et rôles de la réponse immunitaire innée dans le cadre de ce nouveau modèle. Finalement, l’étude in vitro de conditionnement ouvre la voie à plusieurs expériences complémentaires qui seraient pertinentes de réaliser. D’abord, il serait intéressant de mesurer l’expression de la TH dans les cellules SH-SY5Y suite aux différents traitements du protocole. En