Chromatographie liquide (LC) et spectrométrie de masse (MS): principes

Depuis les années 1990, le développement des instruments de LC-MS ont permis un déploiement de cette technique dans les laboratoires de biochimie médicale grâce à leur robustesse et la diminution de leur coût. Les principes de ces deux techniques, la première étant séparative, la deuxième jouant le rôle de détecteur, sont explicités ci-après, avec une attention plus particulière aux modes de fonctionnement qui ont été utilisés dans cette étude.

1.3.1.1 Chromatographie liquide

La chromatographie liquide (LC) est une technique séparative dans laquelle la phase mobile est liquide. Elle est dite « haute pression » ou « haute performance » (HPLC) depuis l’utilisation de colonnes dont les particules présentent des diamètres de 10 µm ou inférieurs. En HPLC, la phase stationnaire est généralement une colonne constituée d’un greffage par silice. La séparation des solutés s’effectue selon leurs affinités pour les phases stationnaire et mobile. Le choix de ces deux phases (i.e. la colonne analytique et les solvants et potentiels additifs) en fonction des analytes que l’on souhaite séparer, constitue donc le paramètre essentiel de cette technique. Le nombre de plateaux théoriques, donnée purement théorique représentant l’équilibre du soluté entre les phases mobile et stationnaire à chaque temps, permet d’évaluer l’efficacité d’une colonne pour un composé donné avec des phases données. Par ailleurs, les conditions d’utilisation de la (ou les) phase(s) mobile(s) sont également primordiales. L’utilisation en mode isocratique (phase mobile identique tout au long de l’analyse) est de plus en plus restreinte, les utilisateurs préférant le mode gradient (la composition de la phase mobile varie durant l’analyse) (203). Une chaîne de chromatographie liquide comprend différents modules, schématisés en Figure 18.

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Figure 18 : Schéma d’une chaîne de chromatographie liquide, d’après l’Université de Lille (204)

1.3.1.2 Spectrométrie de masse

La spectrométrie de masse (MS) est une méthode d’analyse permettant la détermination de la structure et des masses moléculaires des composés analysés ainsi que leur quantification. Actuellement, cette technique est largement couplée à des méthodes séparatives telles que la chromatographie en phase gazeuse ou liquide.

Le spectromètre de masse comprend différents modules placés en série, qui permettent successivement l’évaporation du solvant et l’ionisation des molécules de l’échantillon (source), l’accélération des ions formés ainsi que leur séparation en fonction des rapports masse sur charge (m/z) (analyseur) et enfin leur détection (205).

Concernant la source, plusieurs méthodes d’ionisation sont disponibles, le choix dépendant des propriétés physico-chimiques des molécules à étudier et des renseignements désirés. L’ionisation par impact électronique et l’ionisation chimique à pression réduite sont réservées aux composés facilement volatilisables et de faible masse moléculaire, et sont souvent couplées à la chromatographie en phase gazeuse. La désorption et l’ionisation par impulsion laser assistées par une matrice (source

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MALDI) sont utilisées pour les molécules à masse moléculaire élevée (> 500 Da) et sont fréquemment couplées à un spectromètre de masse à temps de vol. Les méthodes d’ionisation à pression atmosphérique, à savoir l’électro-nébulisation ou électrospray (ESI) et l’ionisation chimique à pression atmosphérique, sont idéalement utilisées en couplage avec la chromatographie en phase liquide pour les molécules ionisables et polaires, en particulier de faible masse moléculaire.

L’ionisation par électro-nébulisation, représentée en Figure 19, consiste en la pulvérisation d’une solution à faible débit et en l’ionisation des espèces qu’elle contient grâce à l’utilisation d’un champ électrique en sortie du capillaire (nébuliseur). L’échantillon est pulvérisé sous forme de gouttelettes qui vont se charger et diminuer de taille car le solvant est progressivement évaporé à l’aide d’un gaz neutre à contre-courant (azote chauffé). Les ions formés entrent ensuite dans le spectromètre de masse. Le choix du solvant, le débit de phase mobile et la différence de potentiel sont donc primordiaux, car ils influent sur la qualité du nébulisât.

Figure 19 : Source d’ionisation à pression atmosphérique par électro-nébulisation en mode positif, d’après Bioforma (205).

L’analyseur de masse permet la séparation des ions formés dans la source en fonction de leur rapport m/z. Plusieurs types sont disponibles, mais nous nous focaliserons ici uniquement sur le type quadripolaire, dont le fonctionnement repose sur le mouvement d’ions dans un champ

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électrique oscillant. Cet analyseur est constitué successivement d’un préfiltre, série de lentilles électroniques permettant la convergence et l’accélération des ions sortant de la source, puis d’un quadripôle (le plus souvent 4 barres entre lesquelles sont établies des différences de potentiel), le tout débouchant sur un détecteur. Les changements de potentiels appliqués à ces barres permettent l’oscillation des ions de différentes masses jusqu’au détecteur.

Plusieurs quadripôles peuvent être couplés entre eux en série, constituant ainsi un spectromètre de masse en « tandem » (MS/MS) (Figure 20). Classiquement, le premier quadripôle (Q1) est utilisé pour sélectionner un ion, le deuxième (Q2) afin de le fragmenter, et le troisième (Q3) permet d’analyser les ions fils issus de la fragmentation. Q1 et Q3 sont des quadripôles permettant la séparation des ions. Q2, appelé cellule de collision, n’a pour rôle que de focaliser les ions au centre des barres, lieu de formation des ions fragments par collision, grâce à l’introduction d’un gaz de collision. Plusieurs configurations peuvent être mises en œuvre en fonction des réglages de Q1 et Q3, suivant que l’on utilise le mode statique (potentiel fixe, ne permettant de détecter qu’un ion à un rapport m/z donné), ou le mode balayage (détection de tous les ions dans une gamme de rapport m/z prédéfinie). La procédure « Multiple Reaction Monitoring » (MRM) ou « Selected Reaction Monitoring » (SRM) utilise Q1 et Q3 en mode statique. Q1 sélectionne exclusivement l’ion parent, tandis que Q3 se focalise sur l’ion fils choisi. Cette double sélection, permettant de diminuer le bruit de fond, est particulièrement utilisée lorsqu’une quantification est souhaitée.

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Figure 20 : Schéma d’un spectromètre de masse en tandem, d’après Cheillan et al (206).

Les 9 molécules que nous souhaitons quantifier dans cette étude sont toutes polaires, de faible poids moléculaire et ionisables, rendant l’utilisation de l’ionisation à pression atmosphérique possible. Nos molécules étant également hydrosolubles, la chromatographie liquide constitue donc la méthode séparative de choix. Le mode MRM utilisé permet la quantification de chacune. L’utilisation de l’HPLC-MS/MS avec ionisation par électro-nébulisation constitue donc la technique utilisée dans notre étude.

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