CHAPITRE V: Reporter Gene Analysis of Human ALOX5 Promoter Polymorphisms
6.3 Chapitre IV : Le LPS induit l’expression du gène ALOX5 et l’activité
Il est évident que le thème de cette thèse porte sur la 5-LO, qui est codée par le gène ALOX5. Le chapitre IV avait donc pour but l’étude de la régulation de l’expression du gène ALOX5 suite à la maturation des lignées monocytaires humaines. Certaines études avaient lié la maturation des cellules monocytaires Mono Mac 6 avec l’expression du transcrit et de la protéine [169,171,235]. Étant donné que le traitement des cellules MM1 avec le LPS les orientent vers un phénotype plus mature [236], nous avons postulé l’hypothèse que le LPS pourrait aussi moduler l’expression de la 5-LO dans ce modèle.
D’abord, les résultats de Genois et al. ont été confirmés en mesurant l’expression du marqueur monocytaire CD14 des cellules humaines MM1 traitées au LPS et au TGF-β. Nous avons utilisé le TGF-β puisqu’il augmente faiblement la transcription du gène et régule plutôt l’élongation et la stabilité de l’ARNm [171]. Comme l’étude précédente, le LPS seul a augmenté l’expression du CD14 après 72h alors que le TGF-β était sans effet. Curieusement, un déplacement biphasique de l’expression du CD14 chez les MM1 a été observé, ce qui suggère deux populations distinctes. Pour appuyer nos résultats obtenus avec les cellules MM1, nous avons aussi étudié la maturation d’une deuxième lignée monocytaire, les cellules THP-1. Cette lignée cellulaire a aussi démontré un phénotype plus mature à la suite du traitement au
LPS. Par contre, il y avait certaines différences entre les deux lignées. Par exemple, le TGF-β rendait les THP-1 adhérentes, alors que ce n’était pas le cas pour les MM1. Par la suite, la capacité de biosynthèse des LT par les cellules matures a été évaluée. En premier lieu aucune production LT n’était détectée chez les MM1 après une stimulation à l’ionophore. Par contre, les cellules traitées au LPS et au TGF-β produisaient une quantité significative de LT lorsque stimulées avec l’ionophore. Lorsque les cellules étaient traitées avec la combinaison des deux agonistes, nous avons observé un effet synergique où les cellules synthétisaient dix fois plus de LT comparativement à celles traitées avec un agent seul. Pour les cellules THP1, un niveau de base de LT était synthétisé lorsque stimulées avec l’ionophore sans prétraitement, mais une augmentation de biosynthèse de LT dû aux LPS et au TGF- β a également été mesurée. Nous étions cependant surpris d’observer des profils de LT distincts entre les deux lignées monocytaires. Notamment, les cellules MM1
ont produit principalement du LTE4, tandis que le LTC4 et le LTD4 ont formé la
majorité des LT produits par les THP-1. Cette capacité des lignées monocytaires de synthétiser majoritairement les cysLT est en accord avec les capacités des
monocytes primaires et des MM6 qui produisent surtout le LTC4 [237,238]. La
différence des profils entre les MM1 et THP-1 nous a toutefois poussé de déterminer si que la capacité des cellules à synthétiser différents produits de la 5-LO est modulée par la maturation des cellules. Par contre, le traitement au LPS et au TGF- β ou la stimulation à l’ionophore n’ont pas influencé la capacité des cellules à
transformer le LTA4 exogène vers un profil différent de LT. Il resterait donc à
déterminer si que les profils de cysLT varient entre les deux lignées cellulaires en conséquence d’expression ou d’activités distinctes des enzymes responsables de
leur biosynthèse, comme la LTC4 synthase, les GGT, ou les MBD.
Afin de définir les mécanismes par lesquels la biosynthèse des LT est induite, nous avons procédé avec l’étude de l’expression de la 5-LO. Premièrement, le LPS et le TGF-β ont augmenté l’expression du transcrit avec un effet synergique impressionnant qui a amplifié l’expression de la 5-LO de 54x et de 13x après 72h
n’est pas présente au niveau basal dans les MM1, ce qui correspond avec l’absence de LT dans les cellules non-traitées. Par contre le LPS et le TGF-β ont induit l’expression protéique avec un niveau maximal à 72h qui est aussi conforme avec l’effet synergique observé pour la biosynthèse des produits de la 5-LO.
Précédemment, des études ont démontré que le TGF-β agit en activant la cascade signalétique des SMAD3/4 et par leur recrutement aux sites de reconnaissances retrouvés dans la région distale du gène ALOX5 [171,172]. Par contre, les mécanismes par lesquels le LPS peut induire l’expression de la 5-LO ne sont pas connus. D’ailleurs, Lee et al. ont étudié l’activation du promoteur ALOX5 de la souris par le LPS. Ils ont démontré que le LPS activait la voie de NFκB et de Sp1 via le récepteur TLR4 et conséquemment entrainait l’augmentation de l’expression du gène [239,240]. Toutefois, le promoteur ALOX5 murin contient uniquement un motif de reconnaissance Sp1 et un motif NFkB et n’est surtout pas représentatif du promoteur humain [241]. Nous avons poursuivi alors avec l’étude du promoteur
ALOX5 humain dans nos lignées monocytaires. D’abord un fragment qui recouvre
la région de -993 à +14 pb relatif au site d’initiation de la traduction a été inséré dans le vecteur rapporteur pGL4.17. Nous avons choisi cette séquence contrairement à celle d’environ 280 pb publiée dans les études précédentes puisqu’elle est plutôt représentative de la séquence présumée du promoteur décrite par Hoshiko et al [137,144,146,148,242]. Selon nos essais rapporteurs, le LPS induit l’activité transcriptionnelle dans les MM1 et les THP-1. D’autre part, le TGF-β était sans effet, ce qui est conforme avec la littérature [146,242]. Il faut noter que le protocole expérimental a limité l’analyse de l’activité transcriptionnelle du promoteur à 6h post- transfection pour des raisons variées, comme la perte du signal à des temps plus longs. Cette période semble courte contrairement à l’expression protéique qui est au maximum à 72h. Mais l’expression de la 5-LO implique divers mécanismes transcriptionels et traductionnels et on a également mesuré une induction significative de l’ARNm après seulement 24h.
Afin d’élucider comment le LPS pourrait activer le promoteur ALOX5, nous avons supprimé du vecteur rapporteur le noyau du promoteur (core promoter) riche en GC
puisqu’il est crucial pour l’expression basale. Nous avons observé une baisse importante de l’activité transcriptionnelle en absence des boîtes GC, cependant l’induction dépendante du LPS était toujours présente. Ensuite, comme la cascade signalétique induite par le LPS implique le facteur de transcription NFκB, nous avons enlevé le motif de reconnaissance putatif de NFκB souligné par Hoshiko et al. et que nous avons aussi confirmé par analyse in silico. Cependant la mutation du site n’a pas modifié l’activation du promoteur par le LPS. Afin d’examiner plus loin l’implication de la voie de NFκB dans l’induction de l’expression de la 5-LO par le LPS, nous avons aussi essayé l’inhibiteur BAY11-7082. Mais l’inhibiteur s’est révélé toxique aux cellules MM1 et THP-1 aux concentrations habituellement utilisées. Finalement, nous avons analysé le statut de méthylation du promoteur étant donné que les cellules MM1 n’expriment pas un niveau basal de 5-LO et que son induction par le LPS pourrait donc impliquer une modification épigénétique. En fait, la méthylation du promoteur ALOX5 est responsable de l’expression cellule-spécifique de la protéine [144]. Cependant, aucune méthylation dans la région du promoteur dans les cellules MM1 traitées sans ou avec LPS pendant 72h n’a été détectée. Vu que le LPS est une composante de la membrane externe des bactéries à Gram négatif, il est important de bien comprendre comment l’endotoxine module la réponse inflammatoire et, en conséquence, l’expression de la 5-LO. Malgré que le mécanisme reste inconnu, ce chapitre démontre pour la première fois que le promoteur de la 5-LO peut être régulé par un agoniste physiologique suivant la maturation des cellules monocytaires.