Chapitre II. Comprendre l’intéret du contrôle de la temperature de
II. E.3. Caractérisation thermodynamique des solutions complexes en présence du Snomax
II.E.3.a) Estimation de l’influence cryoscopique du Snomax dans les différentes solutions
Les valeurs de Tmax obtenues pour l’ensemble des solutions étudiées sont présentées sur le graphique (Fig.II.E-1). Aucune variation importante des valeurs moyennes de Tmax n’a été observée pour les 4 solutions étudiées en fonction des SmC (cf. Fig.II.E-1). Ces résultats confirment les résultats précédemment obtenus pour l’eau pure (cf. partie II.C.) qui indiquaient l’absence d’effet cryoscopique majeur lors de l’ajout du Snomax en solution.
1 Le protocole 2, décrit à la partie (II.C.), a précédemment été défini par notre équipe pour la caractérisation de solutions de cryoconservation [55,56]. Pour rappel, les conditions expérimentales utilisées avec le protocole 2 sont : SV = 10 μL ; CR = -2,5 °C.min -1 ; WR = +2,5 °C.min-1 ; Data Range = Normal ; n = 3 (cf. partie II.C.).
II.E.3.b) Discussion sur les différences entre les Tmax obtenues
En considérant que les variations sur Tmax sont les mêmes que celles sur Tm, les différences observées entre les valeurs de Tmax obtenues pour les différentes solutions peuvent être expliquées par les différences de potentiels chimiques de l’eau en solution et donc par les différences d’osmolalité.
L’IMV étant une solution en isotonicité physiologique, il y a l’équivalent de 300 mOsm de produits osmotiquement actifs dissous par kilogramme d’eau en solution (cette osmolalité a été confirmée par une mesure effectué à l’osmomètre). L’eau présente dans l’IMV dispose ainsi d’un potentiel chimique inférieur à celui des molécules d’eau dans une solution d’eau pure. Il en résulte que la température Tm de la solution IMV est inférieure à la température Tm de l’eau pure.
Ensuite, le DMSO étant une molécule qui modifie considérablement le potentiel chimique de l’eau en solution, la solution H2O+10%(v/v)DMSO possède une Tm encore plus faibles que la solution IMV. En effet, les relevés d’osmométrie affichent une osmolalité de 1540 ± 14 mOsm.kg-1 pour la solution H2O+10%(v/v)DMSO.
Enfin, logiquement, c’est la solution IMV+10%(v/v)DMSO dans laquelle les molécules d’eau possèdent le plus faible potentiel chimique. C’est donc la solution qui possède la plus faible Tm des 4 solutions considérées. Les relevés d’osmométrie affichent 1946 ± 5 mOsm.kg-1 pour la solution IMV+10%(v/v)DMSO.
Les variations de la grandeur Tmax entre les différentes solutions peuvent donc être expliquées par les différences d’osmolalité. Cependant, les valeurs de Tm ne peuvent être obtenues à partir de ces valeurs de Tmax. Or, pour estimer une amplitude de surfusion (information qui sera utilisée dans la 2ème étude de cette partie II.E.) il est nécessaire d’évaluer l’abaissement cryoscopique de chaque solution.
Fig.II.E-1 : Influence de la SmC sur la température maximale de fusion, Tmax, au réchauffement. Protocole N°2. SV = 10μL.
II.E.3.c) Evaluation des valeurs de Tm pour les différentes solutions
Afin d’estimer les valeurs de Tm pour les différentes solutions étudiées, plusieurs méthodes sont possibles.
Tout d’abord, il est possible d’utiliser la relation existant entre l’osmolalité et l’abaissement cryoscopique (cf. Eq.I.B-3). Ainsi, pour l’IMV, solution ayant une osmolalité de 300 mOsm.kg-1, l’abaissement cryoscopique équivalent est de : -0,557 °C. Pour la solution H2O+10%(v/v)DMSO, une osmolalité de 1540 ± 14 mOsm.kg-1 correspond à un abaissement cryoscopique de -2,835 °C. Enfin, pour la solution IMV+10%(v/v)DMSO, une osmolalité de 1946 ± 5 mOsm.kg-1 correspond à un abaissement cryoscopique de -3,572 °C.
Il est ensuite possible de vérifier les valeurs obtenues grâce à cette méthode avec les valeurs présentées dans la littérature. Dans cette étude, seule la composition exacte du mélange « H2 O-DMSO » est connue (la composition exacte de la solution IMV est complexe et n’est pas fournie par le fabricant). Le diagramme de phase du mélange « H2O-DMSO » a été largement étudié dans la littérature [215,423]. C’est donc pour la solution H2O+10%(v/v)DMSO que nous effectuons la comparaison. La valeur de Tm estimée à partir des tables de la littérature pour cette composition de solution est égale à -2,589 °C d’après l’équation publiée par Kleinhans et Mazur [215] ou -3,020 °C d’après l’équation publiée par Weng et al. [423]. La valeur du « second coefficient osmotique du viriel » (B) publiée par Prickett et al. [333] (0,108 kg.mol-1) et celle publiée par Weng et al. [423] (0,096 kg.mol-1) permettent aussi de calculer cette température d’équilibre respectivement égale à -3,360 et -3,289 °C (cf. Eq.I.B-4 et Eq.I.B-3). La valeur moyenne de l’ensemble de ces 4 valeurs est de -3,06 ± 0,31 °C. Une différence est observée entre cette valeur de Tm indiquée dans la littérature et les valeurs de Tm déduites des mesures d’osmolalité. Notons que des interrogations persistent dans la littérature concernant la fiabilité des mesures effectuées à l’aide des osmomètres à pression de vapeur saturante3 en présence de CPA et sur le lien que l’on peut faire entre ces mesures et un abaissement cryoscopique [388]. L’aspect hygroscopique4 ou volatile de certains composés présents dans la solution aqueuse peut perturber les mesures effectuées, tout comme la variation de la proportion massique d’eau dans l’échantillon5, ou celle de la température à laquelle sont réalisées les mesures (l’osmolalité varie en effet avec la température [258]).
Il existe également une méthode basée sur la technologie DSC. Cette méthode permet une mesure plus directe de la température maximale d’équilibre entre les phases, puisque cet appareil est capable de mesurer à quelle température le dernier cristal de glace n’est plus stable en solution. Cette mesure est très satisfaisante lorsque les effets pouvant ralentir la fonte de la glace sont minimisés (ces effets sont détaillés au paragraphe II.A.10.). Pour optimiser les conditions expérimentales de mesure DSC, les expérimentations ont donc été recommencées en modifiant les paramètres d’analyse afin de réduire ces effets. Ces expérimentations n’ont été effectuées que sur les solutions sans Snomax puisqu’aucune évolution n’avait été observée précédemment sur les valeurs de Tmax en présence ou en l’absence de Snomax (cf. Fig.II.E-1). A l’aide de ces nouveaux réglages (SV = 3 μL et Data Range = High), les valeurs de Tmax suivantes ont été obtenues (moyennes des n= 3) : 1,54 ±0,32°C ;
3 Le principe de fonctionnement d’un osmomètre à pression de vapeur saturante est détaillé en annexe N°9.
4 Phénomène qui traduit l’attirance de l’eau présente dans l’atmosphère gazeuse vers la phase liquide.
5 En comparaison à de l’eau pure, un mélange aqueux dispose d’une plus faible proportion massique d’eau en solution. Cette variation de la proportion massique d’eau en solution introduit, en comparaison à un échantillon d’eau pure, une modification des pressions dans la phase gazeuse.
0,77 ±0,46°C ; -2,94 ±0,10°C ; -3,72 ±0,31°C respectivement pour les solutions : H2O ; IMV ; H2O+10%(v/v)DMSO ; IMV+10%(v/v)DMSO.
Les résultats obtenus pour les solutions H2O et IMV ne correspondent pas aux valeurs attendues, puisqu’ils sont supérieurs à 0°C. Dans ces deux solutions, la quantité de glace formée au refroidissement, et dont la fusion se produit à une température proche de 0°C, est très importante. Il est donc logique que, malgré les changements effectués dans la procédure expérimentale, les valeurs de Tmax relevées demeurent supérieures aux valeurs attendues pour Tm.
Le résultat obtenu pour la solution H2O+10%(v/v)DMSO est en revanche proche des valeurs publiées dans la littérature [215,423]. Pour le cas de la solution IMV+10%(v/v)DMSO, les conditions d’analyse sont très proches de celles de la solution H2O+10%(v/v)DMSO. Il est ainsi possible de considérer que, puisque la Tm semble être relevée convenablement avec ces nouvelles conditions expérimentales pour la solution H2O+10%(v/v)DMSO, il puisse en être de même pour la solution IMV+10%(v/v)DMSO.
Concrètement, nous avons décidé d’utiliser les valeurs de Tm obtenues grâce à la technologie DSC pour les 2 solutions contenant 10%(v/v)DMSO. Pour la solution IMV, nous avons conservé la valeur calculée à l’aide du lien théorique entre l’osmolalité de cette solution et l’abaissement cryoscopique. Nous considérons donc, pour la suite, les valeurs de Tm suivantes : Tm = 0,00°C pour H2O, Tm = -0,56°C pour l’IMV, Tm = -2,94°C pour la solution H2O+10%(v/v)DMSO et Tm = -3,72°C pour la solution IMV+10%(v/v)DMSO.
II.E.3.d) Quantités de glace créées en fonction de la SmC
De manière identique à l’étude du Snomax portant sur l’eau pure (cf. partie II.C.), il reste à vérifier, pour ces solutions complexes, si l’ajout de Snomax en solution peut avoir une influence sur les quantités de glace formées. Les valeurs des enthalpies de cristallisation n’ont pas été présentées car il y a eu des dépassements du Data Range dans certains cas de grandes amplitudes de surfusion (cf. partie II.C). Les valeurs moyennes obtenues sur les enthalpies de fusion pour les différentes solutions étudiées sont présentées dans le tableau (Fig.II.E-2) :
SmC (mg.L-1) : 0 10-2 1 10 103
Moyenne de la ligne :
(J.g-1)
Solution : Moyenne des ΔHm ± écart-type (n=3) (J.g-1)
H2O 333,20±1,13 329,86±0,82 333,05±0,27 331,95±1,95 331,49±1,10 331,91±1,21
H2O+10%(v/v)DMSO 225,65±1,90 226,59±3,06 224,80±2,67 228,77±3,65 222,87±2,34 225,74±1,95
IMV 314,10±0,99 316,73±1,98 317,65±2,87 315,94±2,36 315,41±2,53 315,97±1,20
IMV+10%(v/v)DMSO 217,82±1,18 219,62±4,69 219,36±2,00 218,56±2,70 219,52±4,29 218,98±0,69
Fig.II.E-2 : Table des enthalpies de fusion de la glace (ΔHm) mesurées dans les différentes solutions et pour les différentes SmC.
Protocole N°2. SV = 10μL. WR = +2,5°C.min-1. Data Range = Normal.
Pour chaque solution, des valeurs similaires d’enthalpie de fusion ont été obtenues, quelle que soit la concentration en Snomax testée. Suite aux discussions de la partie (II.C.), nous concluons, en nous basant sur les résultats obtenues au réchauffement, qu’il existe une absence d’influence de la présence du Snomax sur les quantités de glace fondue. L’impact de l’ajout du Snomax sur les quantités de glace cristallisables au cours du protocole de refroidissement et réchauffement appliqué est donc faible.
II.E.4. Précision sur la nucléation initiée par un INA dans une solution
aqueuse en présence de solutés
Une précision importante doit être apportée avant l’étude N°2. Il a été montré dans la partie (II.C.) que, pour des conditions expérimentales données (SmC et SV donnés), la sous-population d’INA responsable de la nucléation dans de l’eau pure est déterminée de manière probabiliste. Il est possible de postuler que, dans les mêmes conditions expérimentales, la même sous-population d’INA est probablement responsable de la formation du germe qui initie la nucléation dans une solution complexe. Il est nécessaire de vérifier cette affirmation. Si elle est exacte, il est alors possible, à partir des relevés des Tn obtenues pour les différentes solutions, de déceler l’influence des différents solutés sur la nucléation initiée par ces INA. Cette influence est l’information que nous recherchons afin de pouvoir définir comment un utilisateur du Snomax doit procéder pour pouvoir initier la nucléation dans une gamme de température souhaitée dans une solution complexe de cryoconservation.
Il a précédemment été montré qu’il existe une relation linéaire entre l’abaissement cryoscopique induit par un soluté en solution et l’abaissement de la température de nucléation homogène induit par ce même solution en solution (cf. Eq.I.B-19 ; d’après : [258,346]). Il existe une relation similaire qui indique la relation entre l’abaissement cryoscopique et la température de nucléation hétérogène initiée par un INA en présence d’un soluté en solution (Eq.II.E-1) [222].
ο܂ܖሺܛǡ ۷ۼۯሻ ൌ ૃܐ܍ܜሺܛǡ ۷ۼۯሻ כ ο܂۴۾ሺܛሻ Eq.II.E-1
ΔTn(s,INA) = Tn(H2O,INA) - Tn(s,INA) : Diminution de la température de nucléation initiée par un INA dans une solution aqueuse en présence d’un soluté (s) par rapport à l’eau pure
°C
λhet(s,INA) : Coefficient de proportionnalité entre ΔTn(s) et ΔTFP(s) qui dépend du type de soluté et du type d’INA ø ΔTFP(s) = Tm(H2O) – Tm(s) : Abaissement cryoscopique dans la
solution aqueuse en présence du soluté (s) par rapport à l’eau pure °C
Le « germe semi-permanent » présent autour de la surface active d’un INA (cf. [313]) est en effet impacté par la modification du potentiel chimique de l’eau en solution. Ainsi, pour une taille de « germe semi-permanent » donnée, ce germe devient critique à une température inférieure à celle dans l’eau pure si un abaissement du potentiel chimique de l’eau en solution intervient. La composition de la solution environnant le germe peut également impacter la taille de ce germe. En effet, les molécules ajoutées en solution peuvent modifier le réseau de liaisons hydrogène en solution ce qui peut induire des modifications des propriétés physicochimiques de l’eau en solution [222]. Le coefficient de proportionnalité (λhet) entre l’abaissement cryoscopique et l’abaissement de la température de nucléation tient ainsi compte de la nature du soluté ajouté dans la solution et du type d’INA responsable de la formation du germe.
II.E.5. Méthode de l’étude N°2
La deuxième étude examine la possibilité de contrôler la nucléation à l’aide du Snomax dans les solutions complexes.
Températures de nucléation (Tn) initiées par l’ajout du Snomax en solution : Concernant l’eau
pure, les valeurs de Tn utilisées ont été celles obtenues dans la partie (II.C.). Concernant les autres solutions testées, les mesures de Tn ont
été effectuées selon un protocole, nommé Protocole N°3: Refroidissement de +10 °C à -80 °C à -2,5 °C.min
-1
« protocole 3 », qui correspond au protocole 1 légèrement modifié. La modification apportée au protocole N°1 est un abaissement à -80 °C de la température minimale de descente en température au lieu de -40 °C. La raison de cette différence provient du fait que, dans les solutions avec DMSO, la proportion maximale de glace cristallisable n’est pas atteinte à -40 °C. Or, nous souhaitions pouvoir déceler l’intégralité du processus de cristallisation pour chaque solution. En dehors de cette modification, les conditions expérimentales choisies ont été identiques à celles de l’étude présentée dans la partie (II.C.). Le SV a été fixé à 5 μL et le Data Range choisi en réglage Normal.
Etude complémentaire liée à la BSA : Une étude de la température de nucléation initiée par
l’ajout du Snomax a ensuite été réalisée sur une solution d’eau pure contenant de la BSA (2 g.L-1). Le protocole 3 a été utilisé avec un volume d’échantillon (SV) de 5 μL et un réglage Normal du
Data-Range. La raison de cette étude complémentaire sera détaillée dans la discussion. Cette concentration
de 2 g.L-1 de BSA a été choisie pour étudier l’effet de cette molécule sans trop modifier la composition de la solution de dilution du Snomax. Les SmC ont tout d’abord été choisies afin de pouvoir comparer les résultats obtenus en présence de BSA à ceux obtenus dans l’eau pure (cf. partie II.C. ; SmC égales à 10-2 ; 1 ; 10 ; 103 mg.L-1). Néanmoins, dans de l’eau pure, seules les sous-populations d’INA de type I et III étaient représentées avec ces concentrations. Ont donc été rajoutées les SmC égales à 10 -4 ; 10-3 et 10-1 mg.L-1, afin que la sous-population de type II soit également représentée et que les éventuels effets de la BSA sur la nucléation puissent être observés pour toutes les sous-populations d’INA du Snomax précédemment décrites (cf. partie II.C.).