C.2.
Synthèse et caractérisation chimique des ChitoOligoSaccharides

Les COS étudiés dans ce manuscrit ont été préparés par A. Moussa et S. Trombotto (laboratoire IMP, CNRS UMR 5223). Cette équipe est spécialisée dans l’extraction, la caractérisation et la synthèse de chitosanes et oligosaccharides pour diverses applications, notamment dans le domaine des sciences de la vie. Ces équipes proposent notamment l’utilisation du chitosane et de ses dérivés oligomères pour la production de biomatériaux3 [85]. Le composé de base utilisé pour synthétiser les COS est du chitosane fourni par la société indienne Mahtani Chitosan®. La chitine qui a été utilisée pour produire ces composés chitosane est, d’après ce fournisseur, produite à partir de carapaces de crevettes. Le chitosane fourni a été presque entièrement désacétylé (DA < 5%) par réaction de désacétylation (cf. Fig.III.C-3). Ce chitosane possède une masse molaire moyenne en nombre (Mn) de 115000 g.mol-1 et une dispersité4 de 2,3.

1 A condition que le pH soit acide et inférieur au pKa du chitosane ≈ 6,5 [327].

2 Les résidus de dégradation des COS sont toujours de la D-Glucosamine qui est une molécule biocompatible.

3 « Ces matériaux à base de polysaccharides sont obtenus sous diverses formes physiques : liquides (solutions aqueuses) ; hydrogels ; formes solides (films et fibres) ; nano ou micro objets de taille, de propriétés interfaciales et de morphologie contrôlées » [85].

4 La dispersité permet de donner une idée de la distribution des masses molaires des différentes macromolécules au sein du polymère. Pour un polymère parfait, où toutes les macromolécules auraient même longueur (et donc même masse molaire), la dispersité serait égal à 1.

Pour la préparation des COS, les chaînes macromoléculaires de chitosanes sont ensuite dépolymérisées selon une réaction de désamination nitreuse en utilisant le nitrite de sodium (NaNO2) comme agent de dépolymérisation (cf. Fig.III.C-4). Le NaNO2 agit spécifiquement sur le groupement NH2 des unités de D-Glucosamine. Il intervient alors une cascade réactionnelle (réactions de désamination nitreuse) qui conduit à rompre les liaisons glycosidiques β-(1Æ4) des chaînes macromoléculaires du chitosane. L’unité monomère obtenue à l’emplacement de la rupture de la liaison glycosidique correspondant au 2,5-Anhydro-D-Manno-Furanose, est notée AMF [296]. En fonction de la quantité de NaNO2 utilisée, il y aura plus ou moins de réactions de dépolymérisation. Il est ainsi possible de contrôler le DP moyen des chaînes que l’on souhaite synthétiser. Ce contrôle s’effectue de manière semi-empirique. En théorie, le nombre de molécule de nitrite correspond au nombre de liaisons glycosidiques β-(1Æ4) rompues. En pratique c’est légèrement différent et c’est en caractérisant le résultat obtenu que l’on peut définir la méthode de production adéquate conduisant au DP moyen souhaité. Cependant, il est uniquement possible d’obtenir une distribution statistique de longueur moyenne des chaînes autour d’une valeur de DP moyen.

Pour contrôler le paramètre DA, les polyméristes sont ensuite capables d’effectuer une réaction de N-acétylation des unités D-Glucosamine. La réaction de N-acétylation consiste à transformer partiellement ou totalement les unités D-Glucosamine en unités N-Acétyl-D-Glucosamine (cf. Fig.III.C-5). Pour cela, l'agent d'acétylation utilisé est l'anhydride acétique. Ainsi, la réaction de N-acétylation est effectuée en solubilisant les COS dans un solvant hydroalcoolique à température ambiante. L'anhydride acétique est ensuite ajouté au milieu réactionnel en quantité stœchiométrique par rapport au nombre de motif D-glucosamine à acétyler.

Fig.III.C-3 : Obtention du chitosane (DA = 0%) par réaction de désacétylation de la chitine. Fig.III.C-4 : Synthèse de chitooligosaccharides par désamination nitreuse de chitosane (DA = 0%). Fig.III.C-5 : Réaction de N-acétylation de chitooligosaccharides (DA = 0%)

Pour chaque série de COS synthétisés, des tests de caractérisation ont été effectués pour évaluer les paramètres DP et DA, vérifier la pureté du produit synthétisé et rechercher les traces éventuelles de résidus liés à l’origine du chitosane utilisé ou liés aux produits de synthèses. Ces caractérisations ont été effectuées à l’aide d’une technique de spectroscopie par résonance magnétique nucléaire du proton (RMN 1H) [2,297].

Dans les expérimentations présentées à base de COS, seuls les paramètres DP et DA ont été modulés à partir du traitement des chaînes macromoléculaires de chitosanes provenant de ce même fournisseur. Ces paramètres ont ainsi été considérés comme les uniques paramètres différenciant les COS synthétisés. La dénomination des COS utilisés a suivi la règle suivante : COSDP_DA_x, avec : DP = le nombre moyen de monomère par chaîne du COS ; DA = le degré d’acétylation moyen des chaînes de ce COS ; x = le numéro de la série de synthèse de ce type de COS. Tout au long du manuscrit, cette dénomination est respectée afin de permettre l’identification des propriétés structurales du COS.

Les COS étudiés dans cette étude sont les suivants :

Nom du COS DPmoyen DAmoyen Concentrations testées (mg.mL-1)

COS7,5_0_1 7,5 0 30 ; 60 ; 90 ; 150

COS10_0_2 10 0 0 ; 12,5 ; 25 ; 50 ; 100 ; 150 ; 200 COS5,5_0_2 5,5 0 0 ; 50 ; 100 ; 150 ; 200 COS10_0_3 10 0 0 ; 25 ; 50 ; 100 ; 150 ; 200 COS10_50_1 10 50 0 ; 12,5 ; 25 ; 50 ; 100 ; 150 ; 200 ; 400

Fig.III.C-6 : Table des COS étudiés dans ce manuscrit.

Pour estimer le taux d’hydratation résiduelle après la purification des composés étudiés, nous avons utilisé des données de la littérature. Une étude précédente effectuée sur les mêmes types de chaînes de chitosane, mais sous une forme polymère, a évalué ces taux d’hydratation [38]. Cette étude a été réalisée par analyse thermogravimétrique (abrégée TGA dans la littérature) et a utilisé l’appareil TGA Q500 (TA Instruments). Ce type d’analyse permet de vérifier l’évolution de la masse des échantillons lors de l’application d’un réchauffement (de +30°C à +400°C) sous flux d’hélium. Une perte de masse peut alors être associée à une

évaporation d’une partie de l’eau liée aux composés5. Cette étude a montré qu’il existe des taux d’hydratation résiduelle après la synthèse, la purification, puis la lyophilisation, qui sont variables en fonction du paramètre DA des chaînes de COS étudiées. Les résultats de cette étude sont présentés sur le graphique (Fig.III.C-6).

A partir de ces informations, nous avons extrapolé les taux d’hydratation des composés COS en fonction du paramètre DA. Pour un DA=0, nous avons considéré une valeur d’hydratation résiduelle du composé COS égale à 6,5%(m/m). Ceci est concordant avec d’autres résultats publiés

5 L’étude a comptabilisé la perte de masse observée jusqu’à une température de +110°C. Au-delà de cette température la perte de masse observée peut également être associée à la dénaturation du produit analysé.

Fig.III.C-7 : Valeurs mesurées des taux d’hydratation résiduelle des poudres lyophilisées de polymères de chitosanes en fonction du paramètre DA. Ces relevés ont été effectuées à l’aide d’une

dans la littérature où une valeur de 6%(m/m) avait été obtenue [97]. Pour un DA=50, nous avons considéré une valeur d’hydratation résiduelle des composés COS égale à 10%(m/m).