Caractérisation du médiateur de « l’effet SREBP1c » des MC

Nous avons ensuite recherché quelle était la nature du signal contenu dans les MC et responsable de l’inhibition de l’expression de SREPB-1.

Au cours d’expériences préliminaires, nous avions déjà soumis les MC à 2 types de prétraitements avant leur utilisation sur les cellules musculaire. Tout d’abord une ultracentrifugation pendant 1h à 100 000g. Cette étape a pour but d’éliminer des MC la fraction particulaire de petite taille, où se trouvent en particulier les exosomes. Ces particules sont connues pour leur potentiel de transmission de signal, en particulier car ils contiennent de nombreux miRNA susceptibles de réguler négativement plusieurs gènes cibles. Cette centrifugation, testée sur plusieurs MC s’est révélée sans effet sur l’expression des ARNm de SREBP-1 dans les myotubes.

Le deuxième type de traitement a été un chauffage à 65°C pendant 20 minutes, de façon à déterminer si un composé thermolabile était impliqué dans la médiation de l’effet. Là encore, aucun effet du traitement thermique n’a pu être mis en évidence sur la capacité des MC à inhiber l’expression de SREBP-1 dans les myotubes. Cette absence d’effet semble exclure la participation d’un élément protéique dans les effets du MC sur l’expression des ARNm de SREBP-1.

103 Nous avons ensuite pu utiliser le système gène rapporteur mesurant l’activité promotrice SREBP-1c dans les cellules HEK en réponse au MC pour valider ces résultats préliminaires et caractériser la nature du médiateur contenu dans les MC.

La première expérience a consisté à utiliser des MC obtenus après des temps d’incubation différents des explants de tissu adipeux. Les résultats sont présentés sur la figure 30.

Les résultats montrent clairement un effet du temps d’incubation des explants sur la capacité des MC à inhiber le promoteur de SREBP-1. Cet effet temps-dépendant est parfaitement cohérent avec l’hypothèse d’un relargage ou d’une sécrétion quantitative par le tissu adipeux d’un facteur capable d’agir sur les cellules cibles.

Nous avons ensuite testé sur les MC les effets de plusieurs traitements (ultacentrifugation pour élimination des exosomes, ou chauffage pour dénaturation protéique) visant à identifier la nature du médiateur contenu dans les MC. Les résultats présentés sur la figure 31 confirment que l’élimination des exosomes ou la dénaturation thermique des protéines ne modifient pas de façon significative l’effet inhibiteur des MC sur SREBP-1.

"52*"," $ ""$" ,$ -3+""$ ""$)52 ")3)5)8"46".=5/+ 2< 42< 62< 82< 92< 322< 342< 2 2)7 3 5 8 46 ", #"" . / ," ", ."/

104 Par contre, de façon très claire, la délipidation des MC supprime complètement l’effet inhibiteur sur le promoteur de SREBP-1c. Ces résultats montrent que le traitement butanol/diisopropyl-ether, qui élimine les fractions lipidiques du milieu conditionné (AG non estérifiés, triglycérides, phospholipides et cholestérol), identifie donc la fraction lipidique du MC comme étant le signal modulant l’expression de SREBP-1c via l’activité du promoteur.

Les deux isoformes SREBP-1a et -1c sont les régulateurs cellulaires de la synthèse de novo de lipide, en induisant l’expression des gènes codant pour les enzymes impliqués dans cette voie anabolique, depuis la formation de l’acétyl-CoA et jusqu'à la production des acides gras à longue chaine insaturé de formule C18 :1 (oléate).

Les facteurs de transcription SREBPs sont soumis à une boucle de régulation négative, dans laquelle le produit terminal est un inhibiteur de l’activité et/ou de la quantité de ce facteur. Ainsi, le cholestérol inhibe le clivage et la production de SREBP-2, et les acides gras insaturés inhibent SREBP-1 (216, 235)

Au vue de nos résultats, nous émettons l’hypothèse que les acides gras insaturés contenus dans le milieu conditionné sont captés par les cellules et agissent ensuite comme un signal négatif sur l’expression de SREBP-1.

Nous avons dans un premier temps confirmé que notre modèle d’étude était bien répondant spécifiquement aux acides gras insaturés, en effectuant une expérience de dose-réponse avec plusieurs acides gras.

8B :8B <8B >8B ?8B 988B 9:8B " " " C" / C%/ C/ % "0#&"% "% 3 "#" !!4 % ;9." "!" ""!!% "! 0' !!29/ !""%#!!!" ""3 " "4-!" !" %#988888"9 3" /4-!" !%>=5":8%"!3%/4%!" %% >81<8%"1! (2" 3/43D;4

105 La dose-réponse montre que si le palmitate C16:0 (AG saturé) n’a pas d’effet, les AG insaturés (oléate C18:1 et linoéate C18:2) inhibent fortement et de façon dépendante de la concentration, l’activité du promoteur de SREBP-1. Il apparaît donc que parallèlement à l’effet d’inhibition par le produit final de la voie de synthèse, les AG extracellulaires apportés par le milieu extérieur sont également capables de réguler l’expression et l’activité de SREBP-1.

Enfin, nous avons évalué, dans notre modèle de mesure in vitro de l’activité du promoteur de SREBP-1c, l’effet de plusieurs sérums de sujets inclus dans la collection DIOMEDE.

2; 42; 62; 72; 82; 322; 342; 2 4 8 32 422 622 .37*2/ .38*3/ .38*4/ # ,!$ # # . ! / #54* . # #/#,!,%# #-3+ !.< /

106 Les résultats présentés sur la figure 33 montrent que les sérums inhibent le promoteur de SREBP-1c pour les 4 sujets testés, avec des niveaux d’inhibition différents. D’après les résultats précèdent, il est probable que ces différences viennent d’une composition sérique en AG différents selon les sujets. Nous avons par ailleurs constaté que le niveau d'inhibition de SREBP-1c par les sérums variait avec l'IMC des sujets sources: l'IMC du sujet 312 responsable de l'effet maximum était de 66 kg/m2, de 41.6 kg/m2 pour le sujet 311, de 38.1 kg/m2 pour le sujet 317, puis de 27.1 kg/m2 pour le sujet 326 qui avait l'effet le moins prononcé sur SREBP-1. Il reste donc important de determiner s’il existe une corrélation positive et significative entre le pourcentage d’inhibition et l’IMC des sujets.

Ces résultats devront être confirmés par une étude exhaustive de tous les sérums de la collection, avec une mesure de l’effet inhibiteur pour chacun. Cette valeur pourra alors être comparée avec les mesures d’ARNm effectuées dans les cellules traitées avec les MC, mais également dans les tissus (muscle et foie) de ces sujets.

Nous prévoyons également de développer rapidement une étude lipidomique sur les échantillons de la collection. Cette approche d’identification et de quantification des différentes espèces d’AG dans les explants de TA (sous-cutané et viscéral), dans les MC obtenus à partir de ces explants, et dans le sérums des sujets, permettra de compléter ces travaux avec comme perspective l’obtention d’une signature sérique de la capacité du sérum à inhiber la synthèse lipidique dans les tissus hépatique et musculaire.

107