Caractérisation de la dormance chez M. truncatula

La dormance des semences de M. truncatula n’ayant jamais été étudiée en détail, une

caractérisation préalable est nécessaire à l’étude du rôle de MtSNF4b sur cette dormance. Les

graines de M. truncatula, comme de nombreuses Fabaceae, sont caractérisées par une forte

dormance physique liée à l’imperméabilité du tégument à l’eau (Quinlivan et al., 1961). Lors

d’une imbibition de graines sèches (0,09g/g de matière sèche) dans l’eau à 20°C, seulement

50% des graines sont imbibées après un mois et 80% après deux mois d’imbibition.

Dans le but d’analyser la dormance physiologique, la dormance physique est levée par

scarification des téguments au moyen de disques de papier de verre dans toutes les

manipulations permettant ainsi une imbibition simultanée des graines. Chez de nombreuses

espèces, la dormance physiologique est levée par la post maturation à sec (PMS). Afin de

caractériser la dormance des graines de M. truncatula, les gousses sont récoltées au moment

de l’abscission et, après dissection, les graines récoltées dans la même semaine sont utilisées

pour les analyses comparatives diminuant ainsi la variation biologique. Après quatre jours,

deux semaines et six mois de PMS (20°C ; 60% d’humidité relative) les graines sont imbibées

à 20°C. Les graines ne germent qu’à 20% au bout de 25 jours lorsqu’elles sont imbibées

quatre jours après l’abscission des gousses (Fig. 1.1A). Lorsque l’imbibition a lieu deux

semaines après l’abscission des gousses, les graines germent avec une T

d’une dizaine de

jours. Enfin, après six mois de PMS, toutes les graines germent en moins de deux jours (Fig.

1.1A).

Le tégument et l’albumen sont généralement les deux enveloppes limitant l’expansion de la

radicule en lui opposant une barrière mécanique et sont d’importants régulateurs de la

germination dans les graines imbibées (Groot et Karssen, 1987). Afin de savoir si la

différence de dormance chez M. truncatula est embryonnaire ou tégumentaire, comme

observé dans les graines de Lactuca sativa, Lycopersicon esculentum et Nicotiana tabacum

(Leubner-Metzger et al., 2005 ; Ni et al., 1993), une analyse de la germination d’embryons

extraits de leurs albumens après six heures d’imbibition à 20°C et imbibés seuls à l’obscurité

a été menée (Fig. 1.1B). La T

des embryons imbibés dans l’albumen est de 10 jours environ

Chapitre 1 : Caractérisation physiologique et biochimique de la germination

109

Figure 1.3 : Effet de potentiel hydrique sur la germination des graines de M. truncatula. Les

graines sont imbibées à 20°C après deux semaines (A), trois mois (B) ou six mois (C) de PMS dans l’eau (symboles pleins) ou dans une solution de PEG à –0,27MPa (symboles vides). Les données sont significatives lorsque l’écart est supérieur à 22% (LSD : Least square deviation ; PMS : post maturation à sec ; PEG : polyéthylèneglycol).

jours et demi reste quatre fois plus élevée que la T

des graines non dormantes, indiquant que

la dormance observée chez M. truncatula semble être due à la fois à la résistance de

l’albumen et à une dormance physiologique embryonnaire.

Parmi les facteurs connus pour interagir avec la dormance, les effets de la lumière et

de la stratification ont été évalués sur les semences de M. truncatula (Fig. 1.2). Les semences

imbibées après deux semaines de PMS germent en une vingtaine de jours à l’obscurité alors

que seulement 20% des graines germent à la lumière à 20°C (Fig. 1.2A). Cette différence

n’est pas retrouvée pour les graines imbibées après six mois de PMS qui germent toutes

immédiatement et à la même vitesse à la lumière qu’à l’obscurité (Fig. 1.2A). La lumière

inhibe donc la germination des graines dormantes de M. truncatula ce qui s’oppose aux

observations faites chez A. thaliana (Shinomura et al., 1996 ; 1998). L’effet de la stratification

sur les graines de M. truncatula est analysé par une exposition de graines imbibées à quatre

degrés Celsius pendant 48 heures après trois semaines de PMS (Fig. 1.2B). La T

de graines

imbibées directement à 20°C est de 10 jours environ, alors que celle des graines

préalablement stratifiées n’est que de quatre jours. La stratification lève donc la dormance des

graines de M. truncatula.

Le potentiel hydrique de base est une caractéristique intrinsèque des semences qui

représente le plus fort potentiel hydrique du milieu dans lequel des graines peuvent germer

(Ni et al., 1993). Afin d’évaluer l’impact de la dormance sur le potentiel de base des graines

de M. truncatula, l’effet du potentiel hydrique du milieu sur germination en fonction de la

durée de PMS est mesuré en imbibant les semences dans l’eau où dans une solution de

polyéthylène glycol (PEG) à –0,27 MPa (Fig. 1.3). Les semences imbibées dans l’eau à 20°C

après deux semaines de PMS germent à 100% en une vingtaine de jours. Les mêmes

semences imbibées dans une solution de PEG à -0,27 MPa n’ont pas encore germé après 25

jours d’imbibition (Fig. 1.3A). Lorsque les graines sont imbibées après trois mois de PMS, la

T

passe de 35 heures à 141 heures (Fig. 1.3B). Après six mois de PMS, la T

est de 17

heures pour les graines imbibées dans l’eau et de 57 heures pour celles imbibées dans la

solution de PEG à –0,27 MPa (Fig. 1.3C). Comme attendu, l’effet du potentiel hydrique sur la

germination décroit avec la levée de la dormance, signifiant que le potentiel de base des

semences de M. truncatula diminue avec le temps de PMS.

Chapitre 1 : Caractérisation physiologique et biochimique de la germination

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Figure 1.4 : Sensibilité de la germination de M. truncatula à l’acide abscissique et à l’acide gibbérellique. Les semences de type sauvage sont imbibées après deux à quatre semaines (B,C et

D) ou après six mois de PMS (A) et imbibées dans un gradient de ABA (A) , de GA (B), d’un inhibiteur de la synthèse d’ABA, le fluridone (C) et d’un inhibiteur de la synthèse de paclobutrazol (D). Les données sont significatives lorsqu’elles montrent plus de 22% d’écart (LSD : Least square deviation ).

Figure 1.5 : Expression de la protéine MtSNF4b dans les différentes lignées de graines. (A)

Analyse par western blot avec un anticorps anti-SNF4b sur quatre lignées de graines RNAi

MtSNF4b indépendantes et trois lignées de graines témoins dont le type sauvage, les graines

transformées avec le vecteur vide (lignée RNAi vide) ou transformées avec le même vecteur contenant une construction RNAi dirigée contre la région proximale du promoteur de

MtENOD40-1 (lignée RNAi contrôle). Les protéines totales sont extraites sur des graines après six heures

d’imbibition à 20°C à la lumière. (B) La quantité relative de MtSNF4b a été mesurée avec le logiciel QuantityOne (Biorad) et exprimée en pourcentage de l’intensité maximum (lignée RNAi vide).

1.2 Dormance et balance acide abscissique /acide gibbérellique chez M.