Capture de séquences d’ADN cibles par hybridation à l’aide de billes

Principe général

Figure 16: Principe général de l’expérience de capture de séquence d’ADN par l’utilisation de billes magnétique.

Figure 15: Séquence connue du gène IrSPI et position des amorces utilisées pour les amplifications PCR. La séquence codante

du gène est en gras avec le codon initiateur ATG en vert, et le codon stop en rouge, la séquence inconnue est en pointillés. Amorces : F1 intron en jaune, F2 intron en vert clair, F3 intron en vert foncé, F4 intron en bleu clair, F5 intron en rose, F6

intron en bleu foncé, F7 intron en gris clair, F1 RACE en lettre capitales marron, F2 RACE en lettre capitales bleues, R2

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Pour obtenir la séquence ADN inconnue en 3’ du gène IrSPI, nous avons utilisé le Kit Dynabeads Streptavidin Trial (ThermoFisher Scientific) (Figure 16). Ce kit permet, après fragmentation de l’ADN, de capturer à l’aide d’une sonde monocaténaire biotinylée complémentaire à une portion connue de la séquence recherchée, un fragment d’ADN contenant à la fois cette séquence et la séquence inconnue du gène recherché.

L’ADN génomique est dans un premier temps fragmenté par sonication ou digestion enzymatique. En parallèle, une sonde monocaténaire est préparée à partir de la séquence connue du gène d’intéret puis biotinylée en son extrémité 3’. L’ADN fragmenté est dénaturé puis mis en contact avec la sonde pour hybridation. L’ensemble est ensuite incubé avec des billes magnétiques afin que les sondes et les billes se lient par interaction covalente biotine-streptavidine, permettant l’isolement des ADN capturés et l’élimination des ADN et des sondes qui ne se sont pas liés aux billes. L’élution du fragment d’intérêt est ensuite réalisée, par rupture de la liaison biotine-streptavidine et sa séquence déterminée par séquencage avec ou sans une étape de clonage.

Synthèse de la sonde monocaténaire et biotinylation

Une sonde monocaténaire de 183 paires de bases (pb), située en 5’ du gène IrSPI a été synthétisée :

5’(TGACTGAGACACAATGCAGATTTCCTGTGCCAGTTACTTCATGCGCCGAAGGGGCTAAACTTAG AACTGTCTACTCCTTTAACAACAATACAAACCAATGCGAGCCTTTGAAGGGGAGCTGTGGAGAAGG TGTGAATCAATTTGAAACTGAAGACTGCTGCAGGCGGGAATGTCCGTACGGAA) 3’.

Un ADN double brin a été amplifié à partir d’un plasmide contenant l’ADNc de IrSPI via les amorces 3F et 4R. Un ADN simple brin est ensuite synthétisé à partir de cet amplicon grâce à l’amorce 4R par PCR asymétrique. Cette réaction a été réalisée dans un volume final de 25µL contenant 0,8X de dNTP, 1X de tampon, 0,4 µM de l’amorce 4R, 5U de Taq polymérase (TaKaRa, Ozyme) et 300 ng d’ADN de tique. Le poids moléculaire du produit de PCR vérifié

par électrophorèse révélée par GelRed®, il est ensuite purifié en utilisant le kit Gel and PCR

Clean up (Macherey-Nagel). La sonde néosynthétisée est alors biotinylée en son extrémité 3’ d’après les recommandations du kit Biotin 3’ End DNA Labeling Kit (Pierce, ThermoFisher Scientific). La biotine est incubée avec 25 pmol de sonde pendant 30 min à 37°C en présence de Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) catalysant la fixation de la biotine en 3’ de la sonde, réaction stoppée par l’ajout d’EDTA 0,2 M. L’ajout de 50 µL de chloroforme/isoamyl alcool (V/V) va permettre ensuite, après 2 minutes de centrifugation, l’extraction des sondes biotinylées se trouvant dans la phase aqueuse.

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Fragmentation de l’ADN

L’ADN total de tique est fragmenté par digestion enzymatique ou sonication de manière à obtenir des fragments d’une taille compatible avec l’hybridation sur la sonde (taille maximale des fragments compatibles avec le kit : jusqu’à 1 kb).

En se basant sur un autre gène d’I. ricinus (NDI, numéro d’accession : JN248424.2) et sur le supercontig d’I. scapularis présentant le pourcentage maximum d’identité avec IrSPI, DS965545 (Vectorbase), nous avons sélectionné des enzymes de restriction dont les sites de restrictions étaient fréquents sans l’être trop et n’étaient pas présents dans la séquence de la sonde, tout en tenant compte de la présence d’au moins un site de restriction en 5’ de l’exon 2 d’IrSPI pour pouvoir capturer de longs fragments d’ADN en 3’. Ainsi, trois enzymes ont été sélectionnées, Ase I, Hinc II et SnaB I (New England Biolabs), et testées séparément ou ensemble pour Ase I et Hinc II.

Chacune des digestions enzymatiques a été réalisée avec 1µg d’ADN de tique, 10U de l’enzyme de restriction et 1X de tampon approprié (NEB 3.1 pour les enzymes Ase I et Hinc II, et cutsmart pour l’enzyme SnaB I), dans un volume total de 50 µl pendant une heure à 37°C. Les enzymes ont ensuite été inactivées par la chaleur en suivant les recommandations du fabriquant (New England Biolabs) et les produits de la digestion utilisés pour l’expérience de capture.

La sonication de l’ADN a été réalisée avec 1 µg d’ADN de tique dans un volume de 1 ml en utilisant le sonicateur Bandelin HD 2070, avec la sonde MS 72. Différentes puissances (20% et 50%) et temps de sonication ont été évalués (2 fois 15 secondes, 2 fois 30 secondes, 1 et 2 minutes). L’ADN est ensuite concentré en suivant les instructions du kit NucleoSpin « Gel and PCR Clean up » (Macherey-Nagel) dans un volume final de 30 µl.

Hybridation de la sonde biotinylée et des fragments d’ADN total

L’ADN double brin fragmenté est dénaturé par chauffage à 100°C pendant 10 minutes, puis la sonde biotinylée est ajoutée (V/V) pour une hybridation réalisée à 60°C au bain-marie à sec pendant 3h.

Isolement des fragments d’ADN d’intérêt via les billes magnétiques

Le kit contient quatre types de billes magnétiques dont les propriétés diffèrent : M-270 Streptavidin, M-280 Streptavidin, MyOne Streptavidin C1 et MyOne Streptavidin T1. Les deux premières présentent un calibre de 2,8 µm et une capacité de liaison avec la sonde biotinylée de 200 pmol/mg de billes tandis que C1 et T1, de calibre 1µm, ont une capacité de liaison de 500 pmol/mg et de 400 pmol/mg respectivement. Une fois rincées, ces billes magnétiques permettent, grâce aux interactions entre la biotine et la streptavidine, de lier les complexes

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sondes/ADN. Les trois types de billes M-280, C1 et T1 ont été testés ici. Après hybridation des complexes sonde/ADN, leur isolement utilise les propriétés magnétiques des billes qui vont les retenir lors des 3 lavages successifs. Afin de récupérer les complexes sonde-ADN, deux conditions d’élution ont été évaluées : eau à 70°C ou une solution de 95 % de formamide en 2M EDTA dans un volume final de 100 µl.

Dans le cas des élutions au formamide, l’éluât a été purifié à l’aide du kit « NucleoSpin Gel and PCR Clean up » (Macherey-Nagel) et repris dans 22 µl.