CaMKII et l’endothélium

L’étude de le la fonction endothéliale est complexe dû au fort potentiel de différenciation et de modification du patron d’expression protéique des CEs en culture. De plus, la perte de la structure qu’est la PME engendre inévitablement une modification de l’homéostasie endothéliale via une relocalisation des effecteurs naturellement localisés dans ce microdomaine. Ainsi, l’utilisation d’artères entières permet de conserver l’intégrité artérielle et la polarité fortement affectée par le processus de culture. Tout comme pour les autres types cellulaires, les diverses fonctions endothéliales semblent fortement requérir CaMKII.

1.4.3.1 Les isoformes exprimées dans les cellules endothéliales

De nombreux résultats discordants sont retrouvés dans la littérature concernant les isoformes de CaMKII exprimées dans l’endothélium. Puisque les premières études concernant CaMKII semblaient localiser CaMKIIα et β strictement au niveau neuronal, tandis que CaMKIIδ et γ étaient plutôt considérées comme étant présentes dans les autres tissus [523, 524], plusieurs études sur l’endothélium ont considéré uniquement l’étude de CaMKIIδ et γ en excluant la présence potentielle des isoformes « strictement localisées au niveau cérébral ». À titre d’exemple, des études d’immunobuvardage de type Western sur différents types de CEs en culture (HUVEC, CEs artérielles bovine; BAEC, et CEs de microvaisseaux du derme humain; HDMEC) utilisant un anticorps reconnaissant toutes les isoformes de CaMKII résultaient en la présence d’une bande correspondant à un poids moléculaire d’environ 50 kDa [525]. Cette bande a été directement associée par les auteurs à CaMKIIδ bien que CaMKIIα possède un poids moléculaire similaire. Une autre étude examinant la présence de CaMKII dans des CEs cérébrales de rat (RBEC) par une technique d’hybridation in situ a ciblé CaMKIIα comme isoforme exprimée. Cependant, lors de cette étude, la présence de CaMKIIδ et γ n’a pas été évaluée [526]. Ainsi, plusieurs lacunes peuvent être soulevées dans la méthode d’identification telle que l’exclusion de prime abord de la possibilité de certaines isoformes. Des études au laboratoire ont permis d’effectuer une évaluation complète de l’expression et de la localisation des 4 isoformes de CaMKII dans l’endothélium natif d’artères de résistance de souris. Les résultats démontrent une expression de CaMKIIα, β et δ au niveau de

l’endothélium. CaMKIIα et β présentent une localisation homogène dans le cytoplasme de la cellule ainsi qu’une expression particulière au sein des fenestrations de la LEI (régions correspondant aux PMEs). CaMKIIδ semble restreinte à la membrane plasmique ainsi qu’à la région périnucléaire qui pourrait correspondre à l’appareil de Golgi. La présence de CaMKIIδ dans la PME n’a pas été observée [527]. L’observation d’une localisation spécifique des isoformes suggère un rôle différentiel de ces dernières dans la fonction endothéliale.

1.4.3.2 Les fonctions endothéliales régulées par CaMKII

Plusieurs études ont ciblé CaMKII comme étant un régulateur de fonctions cellulaires de bases en jouant le rôle d’intermédiaire au second messager qu’est le Ca2+. Il a été détaillé dans la section 1.3 que l’endothélium présente une vaste gamme de dynamiques calciques, dont des oscillations calciques. L’intérêt de CaMKII réside dans sa capacité à présenter des niveaux d’activation variés en fonctions des oscillations calciques intracellulaires. Ainsi, le lien entre CaMKII et les fonctions endothéliales a été étudié.

La perméabilité vasculaire consiste en la capacité des composés (ions, molécules, cellules immunitaires) à traverser la monocouche endothéliale afin d’atteindre la média. Une altération des mécanismes de perméabilité vasculaire peut mener à des conditions pathologiques telles que l’athérosclérose [528]. La thrombine est un agoniste largement utilisé dans le domaine vasculaire afin d’induire une augmentation de la perméabilité vasculaire [529]. L’ajout de thrombine augmente le niveau d’activité de CaMKII reflété par son état de phosphorylation en Thr286 [525] et l’inhibition ou la réduction de l’expression de CaMKII réduit la perméabilité vasculaire induite par cet agoniste [525, 530] suggérant que CaMKII favorise la perméabilité vasculaire. Cette perméabilité repose sur plusieurs mécanismes, dont l’intégrité des jonctions intercellulaires qui dépend fortement des dynamiques reliées au cytosquelette. L’utilisation d’agents pharmacologiques inhibant CaMKII a permis de démontrer qu’elle contrôle le réarrangement du cytosquelette induit par la thrombine [530- 532]. La communication intercellulaire semble être un facteur primordial dans cette altération de la perméabilité induite par l’inhibition de CaMKII. D’une part, une inhibition des jonctions GAP réduit la perméabilité vasculaire [533]. D’autre part, l’expression des Cx induite par la bradykinine (BK) qui augmente également la perméabilité vasculaire est réduite lors de

l’inhibition de CaMKII [531]. Bien que cela n’ait pas été évalué dans l’endothélium, il a été démontré que CaMKII pouvait directement phosphoryler la Cx43 provenant de ventricules [534] qui constitue une des trois Cx exprimées dans l’endothélium [74]. L’ensemble de ces résultats positionne CaMKII comme régulateur de la perméabilité et de la communication endothéliale, mais l’identification des voies de signalisation spécifiques n’est pas complétée.

Le rôle des dynamiques calciques dans la fonction endothéliale est sans équivoque. Par ailleurs, de nombreuses études ont mis en lumière le rôle de CaMKII dans la régulation des dynamiques calciques intracellulaires dans d’autres types cellulaires. Au niveau de l’endothélium, CaMKII joue un rôle dans le mécanisme de SOCE. Il est possible d’induire ce dernier par l’application extracellulaire d’ATP qui, via la liaison aux récepteurs purinergiques, induit un relargage des réserves intracellulaires en Ca2+ suivi d’un influx calcique [535]. Il s’avère que l’inhibition de CaMKII dans des BAECs altère les cinétiques des augmentations calciques transitoires induites par l’ATP, plus spécifiquement la deuxième phase du signal calcique associée à l’entrée de Ca2+. Ceci suggère que l’établissement du SOCE requiert l’activation de CaMKII [377]. De façon surprenante, l’application de KN-93 ou d’AIP sans aucune stimulation supplémentaire engendre une libération de Ca2+ similaire à l’ATP ce qui suggère que CaMKII exerce une inhibition basale des protéines impliquées dans la libération de Ca2+ par les réserves intracellulaires. L’inhibition des IP3Rs par l’application de 2- aminoethoxydiphenyl borate (2-APB) affecte considérablement les augmentations calciques transitoires induites par l’ATP ou par le KN-93 suggérant que la libération de Ca2+ _{est générée} par les IP3Rs [377, 536]. Ces résultats appuient le fait que CaMKII peut réguler négativement les IP3Rs endothéliaux tel qu’observé dans les myocytes cardiaques.

L’activation Ca2+-dépendante de la NOS-3 a été décrite en détail précédemment. Cependant, l’activité de cette enzyme ne se résume pas à une régulation directe par le Ca2+ puisque plusieurs aspects de son activité peuvent être régulés des kinases comme CaMKII qui présente une activité dépendante du Ca2+ (Figure 24). La modulation des dynamiques calciques endothéliales par CaMKII peut constituer une régulation indirecte de la NOS-3. Une régulation indirecte peut également provenir de la régulation de sa transcription. L’augmentation de l’ARNm de NOS-3 induit par l’histamine sur des HUVECs [537] ou par le H2O2 [538] ou les contraintes de cisaillement [539] sur des BAECs est considérablement

affectée par l’inhibition de CaMKII suggérant un rôle de cette kinase dans l’aspect transcriptionnel de ce gène. Finalement, la modulation indirecte de NOS-3 via CaMKII peut être générée par l’interaction entre CaMKII et la NOS-3 qui favorise le détachement de NOS-3 de la membrane plasmique favorisant son activation [531, 540]. Pour sa part, la modulation directe par CaMKII s’effectue via la phosphorylation de divers sites de la NOS-3. Le site le plus décrit correspond à la Ser1177, un site phosphorylable par AKT, PKA et CaMKII, localisé dans le domaine réductase de l’enzyme [541-543]. L’application de KN-93 sur des HUVECs stimulés par la BK réduit la phosphorylation de ce site [540]. Une mutation de ce site (Ser ⇒ aspartate) mimant une enzyme constitutivement phosphorylée augmente considérablement l’activité de la NOS-3 comparativement à une mutation par une alanine [544]. En condition de diabète, une diminution de la phosphorylation en Ser1179 de NOS-3 (équivalent à Ser1177) est observée. Les auteurs suggèrent qu’une réduction de la phosphorylation en Thr286 de CaMKII due à une augmentation de l’activité des phosphatases est en cause. Ceci expliquerait l’atténuation de la production de NO observée dans les aortes du groupe de rats diabétiques [176]. Ces résultats suggèrent que CaMKII est un modulateur de l’activité de la NOS-3 via diverses voies et qu’un débalancement pathologique de ces dynamiques d’activation peut affecter la quantité de NO produit.

Tout comme pour les CMLs, CaMKII régule la migration et la prolifération cellulaire des CEs. Ces mécanismes sont essentiels dans le processus d’angiogenèse. L’ajout de KN-93 a une population de CEs de rétines bovines (BREC pour Bovine Retinal Endothelial Cell) et stimulée par du VEGF réduit fortement plusieurs aspects angiogéniques tels que la migration, la prolifération ou la formation de tubes endothéliaux [545] suggérant que ces mécanismes requièrent l’activité enzymatique de CaMKII. L’inhibition de CaMKII réduit également la migration endothéliale dans des essais de cicatrisation sur des CEs d’artères pulmonaires bovines (PAEC pour Pulmonary Arterial Endothelial Cell) [531]. Une augmentation de l’état phosphorylé d’AKT est également observée dans ces conditions [545]. AKT est reconnue pour être un élément central à plusieurs mécanismes permettant l’angiogenèse [546, 547]. Il s’avère que l’ajout de KN-93 aux BRECs stimulées par le VEGF réduit d’approximativement 80% la phosphorylation d’AKT [545]. Ces résultats suggèrent que CaMKII régule la migration et la

prolifération des CEs lors de l’angiogenèse, un effet probablement médié via la modulation de l’état de phosphorylation d’AKT par CaMKII.

1.5. La mitochondrie

La mitochondrie est un organite spécifique aux eucaryotes aérobiques qui utilisent l’O2 afin de produire de l’énergie, soit l’ATP. Elle constitue l’apport majeur en ATP pour la majorité des cellules, particulièrement au niveau musculaire. Cependant, il a été rapporté que dans l’endothélium, la glycolyse était la principale source d’énergie et qu’elle comptait pour environ 85% de la production d’ATP [548, 549] suggérant que la mitochondrie pourrait y avoir des fonctions accessoires à la production d’ATP. Puisque la mitochondrie joue un rôle dans la régulation des dynamiques intracellulaires en Ca2+ d’une multitude de types cellulaires où elle agit comme tampon calcique [550-552], elle pourrait avoir un rôle similaire au sein de l’endothélium. Le Ca2+ est également un élément essentiel pour la fonction mitochondriale lui permettant de répondre aux variations intracellulaires en Ca2+ _{et d’adapter sa production} d’énergie aux besoins cellulaires [553-555].

Figure 24. Régulation de la NOS-3 par CaMKII.

La protéine kinase II dépendante du complexe calcium/calmoduline (CaMKII) contrôle l’activité de l’oxyde nitrique (NO) synthase endothéliale (NOS-3) par phosphorylation directe, en contrôlant sa localisation ou en augmentant son expression. Ca2+ : Calcium, H2O2 : Peroxyde d’hydrogène, P : Phosphate