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Teste de toxicidade in vitro

Os peixes foram expostos à água de diluição (sem adição de composto tóxico); decorridas às 24 horas, os animais foram sacrificados e, mediante abertura ventral, o fígado foi retirado para preparo do homogeneizado. Previamente lavado com solução de sacarose (25.10-2 M, pH 7.4 a 4oC) para a remoção do sangue, os fragmentos de cada fígado foram suspensos na proporção de 1 g de tecido para 10 mL de uma solução tamponada especial constituída de sacarose 25.10-2M, TRIS 2.10-3M, EDTA 4.10-4M, KCl 10-2_{M, fosfato dissódico 10}-2

M e fosfato monopotássico 10-2M, ajustada para pH 7.4, onde foram homogeneizados em equipamento Potter – Elvejhem, a 250 rpm, por um período de 2 minutos, em banho de gelo. Após centrifugação fracionada (Figura 7), a porção rica nos diversos componentes do compartimento lisossômico (Sedimento IV) foi separada e ressuspensa em solução tamponada. Os lisossomos isolados foram inoculados nas concentrações testes zero, 4,6, 10, 22, 46 e 100% das frações solúveis de B5 e de B100, conforme desenho experimental mostrado na tabela 1. A atividade da fosfatase ácida in vitro foi determinada no sobrenadante das amostras seguindo o princípio metodológico relacionado no item 3.5.1.

Tabela 1 - Desenho experimental referente aos testes in vitro realizados com lisossomos isolados de Oreochromis niloticus.

Concentração (%) Volume FSA (mL) Volume Tampão (mL) Volume Amostra (mL) Volume Total (mL) 0 0 4,0 1 5 4,6 0,18 3,82 1 5 10 0,4 3,60 1 5 22 0,88 3,12 1 5 46 1,84 2,16 1 5 100 4,0 0 1 5

3.7 - Atividade respiratória de mitocôndrias isoladas de células hepáticas de tilápia

Princípio metodológico

A membrana mitocondrial interna é separada em cinco complexos enzimáticos responsáveis pela fosforilação oxidativa mitocondrial, compostos por subunidades responsáveis pelo transporte de elétrons através da membrana. A energia livre gerada pelo transporte de elétrons pela cadeia respiratória é usada para produzir ATP a partir de ADP + Pi. O complexo I remove elétrons do NADH, enquanto o complexo II, coleta elétrons do succinato. Ambas as enzimas, então, transportam os elétrons para a coenzima Q (CoQ). Da CoQ, os elétrons circulam através do complexo III para o citocromo c, em seguida para o complexo IV, e finalmente, o oxigênio produz água. Esta necessidade de oxigênio torna o processo de transporte de elétrons uma cadeia respiratória, a qual responde pela maior parte da utilização corporal de oxigênio. As alterações na cadeia respiratória mitocondrial afetam em conjunto a fisiologia e o metabolismo energético celular (SCHAPIRA, 1996).

A atividade respiratória mitocondrial, medida através do consumo de oxigênio seguiu a técnica descrita por CHEN et al., (1999) e HULBERT et al., (2006). As determinações desta atividade foram efetuadas polarograficamente, utilizando um eletrodo de Clark a uma temperatura de 37oC. Para este registro, foram colocados 3,0 mL da suspensão de mitocôndrias provenientes do sedimento III (Figura 7) em uma cubeta de reação do polarógrafo e, sob agitação constante, registrou-se por um período de 3 minutos o consumo endógeno, isto é, a respiração mitocondrial, na ausência de substrato. As determinações das proteínas totais de cada amostra, que permitiram os cálculos das atividades respiratórias relativas, expressas em nanolitros de oxigênio consumidos por micrograma de proteínas por minuto de experiência, foram efetuadas pela técnica do Folin-biureto modificada por RODRIGUES et al., (1989). A determinação da concentração de proteína mitocondrial foi efetuada a partir da curva padrão, que relaciona os valores de absorbância com as respectivas concentrações.

3.8 - Extração de lipídios totais e determinação de triglicérides e colesterol

Para a extração de lipídios totais, dosagens de colesterol e triglicerídeos o procedimento de exposição dos peixes às frações solúveis em águas foi semelhante àquele realizado para a avaliação da atividade respiratória mitocondrial e determinação da fosfatase ácida no homogeneizado de fígado de peixe. Após exposição, o fígado do peixe foi retirado, pesado, lavado com água destilada, em seguida foi homogeneizado em uma mistura composta por 10 mL de clorofórmio, 10 mL de metanol e 10 mL de água, os quais foram transferidos para o um homogeneizador tipo “waring blendor”, sendo homogeneizado por 30 segundos, em seguida o conteúdo do homogeneizador foi transferido para uma ampola de decantação, onde foi deixado em repouso por cerca de 1 hora para a separação das fases alcoólica-aquosa e clorofórmica. Os lipídios permanecem na camada clorofórmica (fase de baixo). A parte clorofórmica resultante de cada experimentação foi transferida para uma placa de petri, e em seguida, levado para estufa, onde todo o clorofórmio foi evaporado, sendo a quantidade de lipídios determinada por gravimetria, onde o valor dos lipídios totais foi obtido pela diferença entre os pesos da placa de Petri com a amostra após secagem em estufa e a placa sem amostra, e expressos em mg/g de fígado fresco. Essa mesma amostra lipídica resultante foi ressuspensa em 5 mL de clorofórmio e utilizada para as dosagens bioquímicas de colesterol total e triglicerídeos utilizando para ambos Kit comercial Doles.

Princípio metodológico da dosagem do colesterol (Esquema detalhado das reações químicas – Anexo I)

O colesterol foi quantificado através das seguintes reações enzimáticas:

1. Ésteres de colesterol colesterol livre + ácidos graxos

2. Colesterol livre + O2 colesterona + H2O2 colesterol esterase

3. 2 H2O2 + 4 Aminoantipirina + p-Hidroxibenzoato 4 antipirilquinonimina + 4H2O

Princípio metodológico da dosagem dos triglicerídios (Esquema detalhado das reações químicas – Anexo I)

Os triglicerídeos foram quantificados através das seguintes reações enzimáticas:

1. Triglicerídeos glicerol + ácidos graxos

2. Glicerol + ATP glicerol -3-fosfato + ADP

3. Glicerol-3-fosfato dihidroxiacetona + H2O2

4. H2O2 + 4-clorofenol + 4-aminoantipirina 4-antipirilquinonimina +4H2O

Em ambos os procedimentos, o produto formado pela oxidação da 4- Aminoantipirina (4-Antipirilquinonimina) apresentou coloração avermelhada, sendo a intensidade da cor diretamente proporcional à concentração de colesterol ou de triglicerídeos no homogeneizado hepático. A cor avermelhada, resultante da reação, foi medida em espectrofotômetro no comprimento de onda de 510 nm. Os resultados das dosagens de colesterol e triglicerídeos foram expressos em mg/g de fígado fresco.

Lipase

Glicerol cinase

Glicerol 3 fosfato oxidase

Peroxidase

4 - ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram tabulados no software Microsoft Excel e a análise estatística feita no programa GraphPad InStat, com valores de p<0,05 considerados estatisticamente significativos. O Teste de Kolmogorov-Smirnov foi utilizado para a análise de distribuição. Análise de variância (ANOVA) e a comparação de médias

múltiplas por Tukey-Kramer foram utilizadas para determinar a significância

estatística das diferenças entre os grupos.

Para a variável fosfatase ácida in vitro o delineamento experimental para o presente estudo foi composto de dois fatores: tipo de produto com 2 níveis (B5 e B100) e concentração com 6 níveis (Controle, 4,6 , 10, 22, 46 e 100 %). Portanto, o delineamento utilizado foi um fatorial completo 2 x 6. Para análise dos dados foi realizada uma análise de variância de dupla entrada ao nível de significância de 0,05. Foi realizado um teste de Tukey para avaliar os tratamentos comparados ao controle ao nível de significância de 0,05 (UNDERWOOD, 1997; DONCASTER & DAVEY, 2007; VAZ, 2013).

Para as variáveis fosfatase ácida e consumo de oxigênio in vivo, o delineamento experimental foi composto de dois fatores: tipo de produto com 2 níveis (B5 e B100) e concentração com 6 níveis (Controle, 4,6 , 10, 22, 46 e 100 %). Portanto, o fator produto foi aninhado dentro do fator concentração, o que conduziu para um delineamento incompleto uma vez que não há como incluir o fator produto dentro do nível controle (0 %) do fator concentração. Portanto os graus de liberdade para o fator produto aninhado na concentração foram (2-1)*(6-1) = 5 graus de liberdade. Os graus de liberdade do resíduo foram 112-11 = 101. Para análise dos dados foi realizada uma análise de variância de dupla entrada para delineamento aninhado incompleto ao nível de significância de 0,05. Quando o fator aninhado foi significativo foi realizado um teste de Tukey para avaliar os tratamentos comparados ao controle ao nível de significância de 0,05 (UNDERWOOD, 1997; DONCASTER & DAVEY, 2007; VAZ, 2013).

5 - RESULTADOS

5.1 - Análises cromatográficas

As análises cromatográficas foram realizadas com o intuito de investigar a composição das frações solúveis em água e quantificar as substâncias que possam representar riscos ambientais por suas características poluentes e explicar os resultados obtidos no presente trabalho, tomando-se por base os valores limites permitidos pela legislação CONAMA 357/2005 para água doce superficial (Tabela 2). Foram realizadas análises dos BTEX, dos hidrocarbonetos aromáticos e não aromáticos, além do teor de metanol nas matrizes aquosas de exposição, FSA do biodiesel (B100) e do biodiesel comercial (B5). A tabela 2 mostra estes resultados e também os limites estabelecidos pela Resolução CONAMA para os possíveis poluentes, o que permite uma comparação com os valores obtidos nas frações solúveis.

Tabela 2 - Composição química das frações solúveis em água das amostras de B5 (95% de diesel + 5% de biodiesel) e de B100 (Biodiesel)

Compostos Químicos FSA de B5

FSA de B100 CONAMA 357/2005 Benzeno (µg/L) 270 0 5 Tolueno (µg/L) 420 0 2 Etilbenzeno (µg/L) 90 0 90 Xilenos (µg/L) 920 0 300 BTEX Total (µg/L) 1700 0 397 Hidrocarbonetos aromáticos C9s+ (µg/L) 150 40 - Hidrocarbonetos n-aromáticos (µg/L) 170 400 - Metanol (mg/L) 0,7 83 -

Além das analises cromatográficas realizadas em amostras das FSA do B5 e do B100, outros parâmetros físico-químicos também foram mensurados (Tabela 3) nas matrizes aquosas às quais os organismos testes foram expostos, com objetivo

de manter sob controle as boas condições dos testes e afastar possíveis variáveis que pudessem interferir nos resultados das analises relativas à toxicidade das amostras. Além disso, alterações em parâmetros físico-químicos a exemplo do pH, e teores de oxigênio dissolvido e de amônia podem ajudar a explicar o comportamento de enzimas e orgânulos no metabolismo celular.

Tabela 3 – Resultados das determinações de parâmetros físico-químicos de amostras das frações solúveis em água do biodiesel comercial (B5) e do biodiesel (B100).

5.2 - RESULTADOS RELACIONADOS À EXPOSIÇÃO DE OREOCHROMIS

NILOTICUS (TILÁPIAS) À FRAÇÃO SOLÚVEL EM ÁGUA DO BIODIESEL (B100) E

DO BIODIESEL COMERCIAL (B5)

Os resultados de todos os testes realizados no presente trabalho estão representados na tabela 4, através dos valores das médias e dos desvios padrão ( ± σ).

Biodiesel comercial (B5) Biodiesel (B100)

Concentração pH Oxigênio Dissolvido (mg OD/L) Amônia (mg/L) Concentração pH Oxigênio Dissolvido (mg OD/L) Amônia (mg/L) 4,6% 7,02 5,21 1,57 4,6% 7,12 5,93 1,30 10% 6,96 4,96 1,40 10% 7,04 5,83 1,20 22% 6,92 4,92 1,39 22% 6,99 5,72 1,34 46% 6,82 5,40 1,12 46% 6,63 5,16 1,23 100% 6,84 4,02 1,09 100% 6,83 3,97 1,20

Tabela 4 – Resultados dos testes realizados representados através das médias e dos desvios padrão ( ± σ). Exposição in vivo – Atividade da fosfatase ácida

(mUI/L/µg de proteínas totais)

Exposição in vitro – Atividade da fosfatase ácida (mUI/L/µg de proteínas totais)

Concentração (%) _{B5 ( ± σ) B100 ( ± σ) B5 ( ± σ) B100 ( ± σ)} Controle (0) 165,72 ± 17,79 165,72 ± 17,79 108,63 ± 5,83 107,15 ± 6,35 4,6 151,22 ± 8,98 162,51 ± 20,60 121,86 ± 14,67 104,79 ± 18,93 10 105,55 ± 24,39 178,03 ± 15,18 201,93 ± 3,74 151,20 ± 4,81 22 98,50 ± 24,43 183,8 ± 14,42 224,11 ± 44,66 211,85 ± 19,42 46 73,42 ± 3,83 156,36 ± 5,52 419,70 ± 9,43 298,04 ± 35,20 100 36,47 ± 3,04 126,13 ± 5,49 522,87 ± 13,22 402,67 ± 5,86

Atividade respiratória mitocondrial (nL O2 consumidos/µg prot/min)

Dosagem de lipídios totais, triglicerídeos e colesterol

Lipídios totais Triglicerídeos Colesterol

Concentração (%) B5 ( ± σ) B100 ( ± σ) B5 ( ± σ) B100 ( ± σ) B5 ( ± σ) B100 ( ± σ) B5 ( ± σ) B100 ( ± σ) Controle (0) 64,86 ± 4,13 64,86 ± 4,13 124,50 ± 4,89 _{124,50 ± 4,89} 2,83 ± 0,21 2,83 ± 0,21 1,69 ± 0,07 1,69 ± 0,07 4,6 63,62 ± 7,35 68,68 ± 5,67 128,79 ± 6,75 126,74 ± 2,29 3,13 ± 0,92 _{6,38 ± 0,22} 2,85 ± 0,67 4,14 ± 0,31 10 42,36 ± 2,54 113,49 ± 15,97 134,52 ± 7,35 150,81 ± 3,54 3,15 ± 0,73 7,50 ± 0,76 3,73 ± 0,17 5,47 ± 0,93 22 52,21 ± 6,31 119,96 ± 13,01 131,86 ± 2,79 120,23 ± 4,88 3,16 ± 0,53 3,85 ± 0,29 2,11 ± 0,30 3,06 ± 0,07 46 23,93 ± 2,98 88,93 ± 5,03 134,17 ± 1,11 137,05 ± 1,34 3,40 ± 0,11 5,52 ± 0,45 1,77 ± 0,09 3,51 ± 0,14 100 23,52 ± 8,56 151,58 ± 17,28 122,11 ± 3,85 134,03 ± 3,79 2,62 ± 0,17 3,09 ± 0,54 1,67 ± 0,17 2,20 ± 0,35

5.2.1 - INTEGRIDADE DA MEMBRANA LISOSSÔMICA AVALIADA ATRAVÉS DA ATIVIDADE DA FOSFATASE ÁCIDA - TESTE IN VIVO

Os valores referentes às determinações da atividade da fosfatase ácida em organismos submetidos às matrizes aquosas de exposição B5 e B100, no sistema de exposição in vivo (Figura 8) foram expressos em miliunidades internacionais por litro por micrograma de proteínas totais (mUI/L/µg de proteínas totais).

Quando exemplares de Oreochromis niloticus foram expostos a concentrações cada vez maiores das FSA do biodiesel comercial (B5), os resultados indicaram diminuição da atividade enzimática. Os valores de atividade da fosfatase ácida decresceram à medida que as concentrações-teste aumentaram, caracterizando um comportamento dose-dependente, apresentando diferença significativa (p<0,05), em relação ao controle, a partir da concentração teste de 10%.

Quando submetidos à ação da FSA do biodiesel (B100), a fosfatase ácida apresentou leve aumento da atividade enzimática nas primeiras concentrações testadas, embora esse aumento não tenha sido significativo (p>0,05). Nas concentrações mais altas (46 e 100%) os valores da atividade fosfatásica ácida diminuíram, semelhante ao comportamento apresentado pelos animais expostos à FSA do B5, comportamento justificado em virtude das concentrações mais elevadas da FSA apresentarem valores de metanol comprovadamente mais altos. Apenas a concentração teste de 100% apresentou diferença significativa em relação ao controle (p<0.05).

É importante salientar que a toxicidade das frações solúveis em água, utilizadas como matrizes de exposição é determinada por efetores distintos, sendo os BTEX os compostos tóxicos prioritários nas amostras de B5 e o metanol e seus metabólitos, nas amostras de B100; o efeito inibitório observado na atividade da fosfatase ácida caracteriza a ação tóxica dos referidos poluentes.

Figura 8 – Média e intervalo de confiança à 95 % de probabilidade de atividade da fosfatase ácida (in vivo) nas diferentes concentrações (eixo x) e diferentes produtos (linhas). Os asteriscos (*) indicam os tratamentos significativos (p < 0,05) pelo teste de Tukey, sempre comparados ao controle. A atividade da fosfatase ácida foi expressa em (mUI/L/µg de proteínas totais).

5.2.2- INTEGRIDADE DA MEMBRANA LISOSSÔMICA AVALIADA ATRAVÉS DA ATIVIDADE DA FOSFATASE ÁCIDA - TESTE IN VITRO

Quando os peixes foram submetidos às condições do ensaio in vitro, expostos às mesmas concentrações teste do ensaio in vivo, o comportamento enzimático foi de indução da atividade da fosfatase ácida para os combustíveis testados. A atividade da fosfatase ácida (Figura 9) de lisossomos isolados submetidos às diferentes concentrações das FSA foi, em todos os casos, expressa em miliunidades internacionais por litro por micrograma de proteínas totais (mUI/L/µg de proteínas totais).

Os valores de atividade da fosfatase ácida mostraram-se elevados à medida que as concentrações testes aumentaram. De modo geral, o comportamento de indução foi dose-dependente, exceto para a concentração de 4,6% de B100. Foi possível verificar que as concentrações de 10, 22, 46 e 100% de ambos os produtos analisados, diferiram significativamente da concentração controle (p<0,05).

Figura 9 – Média e intervalo de confiança à 95 % de probabilidade de atividade da fosfatase ácida (in vitro) nas diferentes concentrações (eixo x) e diferentes produtos (linhas). Os asteriscos (*) indicam os tratamentos significativos (p < 0,05) pelo teste de Tukey, sempre comparados ao controle. A atividade da fosfatase ácida foi expressa em (mUI/L/µg de proteínas totais).

5.2.3 - COMPOSIÇÃO LIPÍDICA DAS MEMBRANAS HEPÁTICAS DE

OREOCHROMIS NILOTICUS EXPOSTOS ÀS FSA DE B5 E B100

Os teores de lipídios totais, colesterol e triglicerídeos presentes em homogeneizados de células hepáticas das tilápias foram quantificados com o objetivo de correlacionar possíveis alterações nos níveis dessas lípidas aos danos hepáticos apresentados pelos peixes expostos aos diferentes tipos de combustíveis analisados. É importante salientar que a ação tóxica de alguns compostos químicos pode ocasionar a depleção desses constituintes e, consequentemente, interferir na integridade funcional das membranas de orgânulos como lisossomos e mitocôndrias.

Os teores de lipídios totais quantificados a partir dos homogeneizados de fígado de tilápias expostas as diferentes concentrações-teste da FSA do B5 cresceram à medida que as concentrações aumentaram, exceto para a concentração de 100% (efetivamente mais tóxica), onde houve decréscimo no teor dos referidos lipídios, expressos em miligrama por grama (mg/g) de fígado fresco. Em relação ao controle, apenas as concentrações-teste de 10, 22 e 46% apresentaram diferença significativa (p<0,05).

Quando os organismos-testes foram expostos às diferentes concentrações da FSA de B100, houve aumento nos teores dos lipídios, sendo observadas diferenças significativas nos resultados apresentados pelas concentrações-teste de 10, 46 e 100% (p<0,05), em relação ao controle (Figura 10).

Figura 10 – Média e intervalo de confiança à 95 % de probabilidade de teor de lipídeos nas diferentes concentrações (eixo x) e diferentes produtos (linhas). Os asteriscos (*) indicam os tratamentos significativos (p < 0,05) pelo teste de Tukey, sempre comparados ao controle.

Quando os peixes foram expostos a FSA do B5, os teores de triglicerídeos não apresentaram diferença significativa em relação ao controle, nas concentrações- teste estudadas. Contudo, quando o teor de triglicerídeos foi dosado em amostras de fígado de tilápia expostas a diferentes concentrações do B100, estes, apresentaram valores mais altos que os encontrados na amostra controle, e foram também mais altos que os apresentados pelas amostras de B5. Para a matriz aquosa B100, os resultados mostraram que não houve diferença significativa entre os valores da concentração teste de 100% e o valor do controle, enquanto as demais concentrações-teste diferiram significativamente (p<0,05) em relação ao controle.

Figura 11 – Média e intervalo de confiança à 95 % de probabilidade do teor de triglicerídeos nas diferentes concentrações (eixo x) e diferentes produtos (linhas). Os asteriscos (*) indicam os tratamentos significativos (p < 0,05) pelo teste de Tukey, sempre comparados ao controle.

O teor de colesterol dos homogeneizados hepáticos de tilápias expostas as diferentes concentrações da FSA do B5 (expressas em mg/g de fígado fresco), aumentaram em relação ao controle, exceto na concentração de 100%; entretanto houve diferença significativa (p<0,05) em relação ao controle, apenas para as concentrações-teste de 4,6 e 10%. Quando os peixes foram expostos a FSA do B100, o comportamento padrão dos níveis de colesterol foi de aumento, à medida que as concentrações testes aumentaram, com diferença significativa (p<0,05) entre as concentrações-teste e o controle, exceto para a concentração de 100% (Figura 11).

Figura 12 – Média e intervalo de confiança à 95 % de probabilidade do teor de colesterol nas diferentes concentrações (eixo x) e diferentes produtos (linhas). Os asteriscos (*) indicam os tratamentos significativos (p < 0,05) pelo teste de Tukey, sempre comparados ao controle.

5.2.4 - ATIVIDADE RESPIRATÓRIA MITOCONDRIAL COMO BIOMARCADOR DO METABOLISMO ENERGÉTICO DE OREOCHROMIS NILOTICUS (TILÁPIAS) EXPOSTOS A DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE B5 e B100

A atividade respiratória apresentada pelas mitocondriais isoladas de fígado de tilápias, avaliadas pelo consumo de oxigênio (nanolitros de oxigênio consumidos por microgramas de proteínas totais por minuto), em resposta a exposição à FSA do biodiesel comercial (B5) e do biodiesel (B100) encontram-se representadas na figura 12. O metabolismo energético (endógeno/basal) das mitocôndrias isoladas foi inibido

quando os peixes foram expostos à fração solúvel em água do B5. Apenas a concentração de 4,6% não apresentou diferença significativa em relação ao controle (p>0,05). Em contrapartida, quando expostos a FSA do B100, as mitocôndrias apresentaram estimulo do metabolismo energético, resposta possivelmente associada à integridade das membranas mitocondriais. Todos os resultados referentes à matriz de exposição B100 diferiram significativamente do controle (p<0,05), exceto os valores apresentados pela concentração teste de 4,6% (Figura13).

Figura 13 – Média e intervalo de confiança à 95% de probabilidade do consumo de oxigênio (in vivo) nas diferentes concentrações (eixo x) e diferentes produtos (linhas). Os asteriscos (*) indicam os tratamentos significativos (p<0,05) pelo teste de Tukey, sempre compardo ao controle. Consumo de oxigênio expresso em nanolitros de oxigênio consumidos por microgramas de proteínas totais por minuto.

5.2.5 – COMPARAÇÃO ENTRE A ATIVIDADE RESPIRATÓRIA MITOCONDRIAL E A ATIVIDADE DA FOSFATASE ÁCIDA (TESTES IN VITRO) DE

OREOCHROMIS NILOTICUS, SOB EXPOSIÇÃO ÀS FSA DE B5 E B100

Os resultados do presente trabalho apontam semelhanças de respostas no que tange às concentrações de efeito referentes à atividade da fosfatáse ácida quando determinada in vitro e à atividade respiratória mitocondrial. Os resultados apontam a concentração de 10% como a menor concentração de efeito observado (LOEC, Lowest observed effect concentration), tanto para a FSA de B5 quanto para a de B100. Os efeitos tóxicos resultantes das exposições a FSA de B100 em mitocôndrias isoladas podem ser atribuídos ao metanol, principalmente na concentração de 100% onde o teor deste contaminante ficou acima do valor de 47,49 mg/L. (Figura 14).

Como atestam os resultados das analises cromatográficas neste trabalho, a quantidade de metanol presente nas concentrações de 10% da FSA (8,3mg/L), 22% (18,26mg/L) e 46% (38,18mg/L), apesar estarem abaixo do valor que representa a LOEC (47,49 mg/L), anteriormente estimado como a menor concentração de efeito para este tóxico, em testes de toxicidade, utilizando peixes de água doce (KAVIRAJ et al., 2004) determinaram efeitos tóxicos, a partir da concentração de 8.3mg/L de metanol. A similaridade de respostas entre dois dos biomarcadores utilizados (atividade da fosfatase ácida in vitro e os valores da respiração mitocondrial), significativamente diferentes em relação ao controle (0% metanol), a partir da exposição de 10 % da FSA fortalecem a indicação de uma maior sensibilidade para os referidos biomarcadores como utilizados no presente trabalho. Em 100%, a concentração de metanol foi de 83mg/L, valor bem acima do LOEC anteriormente determinado. Dessa forma, podemos inferir que o principal efetor de toxicidade nas amostras das FSA do B100 foi o metanol, enquanto nas amostras das FSA de B5, os compostos BTEX, também quantificados cromatograficamente, contribuíram para os resultados obtidos.

Figura 14 - Comparativo entre a atividade da fosfatase ácida e a atividade respiratória mitocondrial de peixes expostos a diferentes concentrações da FSA de

B5 e B100. (* *) Representa concentrações com significância estatística (p<0,05)

6 - DISCUSSÃO

6.1 - ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA FOSFATASE ÁCIDA EM RESPOSTA A AÇÃO DE XENOBIÓTICOS – TESTES DE TOXICIDADE IN VIVO

O conceito básico que sustenta a utilização de bioindicadores de poluição ambiental se baseia em que os distúrbios por xenobióticos no meio ambiente levam, inicialmente, a uma alteração de uma reação bioquímica em um determinado organismo (VALAVANIDIS et al., 2006). Os biomarcadores bioquímicos são apontados como um sistema de alerta na avaliação da saúde ambiental (PAYNE et

al., 1987) e a manutenção da condição saudável – ou homeostática - está

associada, em grande parte, ao bom funcionamento de sistemas enzimáticos, envolvidos no metabolismo celular.

Dentre os componentes bioquímicos, as enzimas constituem um grupo de substâncias proteicas, com função catalisadora das vias metabólicas, podendo tal

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função ser alterada na presença de um xenobiótico (JONSSON & AOYAMA, 2010). O mecanismo básico de reação de uma enzima envolve inicialmente, a reação com o substrato, para formar o complexo enzima-substrato e, posteriormente, há liberação do produto. Entretanto, este mecanismo básico pode ser alterado, por exemplo, na presença de um agente químico com ação inibitória (JONSSON & AOYAMA, 2010). Assim, a exposição a contaminantes pode causar efeitos variados, tais como: (i) aumento da atividade enzimática no meio extracelular por extravasamento da proteína para este meio (NETRAWALI & GANDHI, 1990; SURESH et al., 1993); (ii) aumento da atividade enzimática no meio extracelular ou intracelular por ativação enzimática, através da interação direta do agente químico com a enzima (GILL et al., 1992; BOUNIAS et al., 1996); (iii) aumento da atividade enzimática intracelular por indução na síntese da proteína (GILL et al., 1992; GILL et