A habilidade de controlar um processo fermentativo de maneira automática e precisa para operação em sua condição ótima é considerada de muito interesse na indústria de bioprocessos. Controles apropriados permitem a redução dos custos de produção e aumento de rendimento, enquanto que ao mesmo tempo mantem a qualidade desejada do produto (Rani, Rao, 1999). Muitas pesquisas estão sendo realizadas para o desenvolvimento de sensores para obter melhor detalhamento e monitoramento de bioprocessos. O acompanhamento e a análise dos componentes biológicos, físicos e químicos de um bioprocesso são de grande interesse e podem ser realizados de duas maneiras: através da retirada de amostra seguida de análise em etapas separadas do volume total do biorreator ou pela integração do sistema analítico para o monitoramento direto, ou seja, em tempo real. A concentração de biomassa, que pode estar relacionada à quantidade de células viáveis ou ao total de células presentes no reator, é uma das mais importantes variáveis analisadas em bioprocessos (Scheper, Lammers, 1994). Muitas metodologias foram desenvolvidas para análise em tempo real ou não, cada uma com suas vantagens e desvantagens. O principal exemplo é a técnica gravimétrica, cujas células são separadas por centrifugação ou filtração. Centrifugação é o método mais barato, porém apresenta desvantagens como: grandes volumes são requeridos e maiores erros são esperados quando avaliadas concentrações celulares de menor densidade; necessidade de pesagem dos tubos antes do procedimento, além da remoção da água adsorvida no recipiente; a demora na inativação das células pode levar ao aumento da biomassa posterior à coleta; a biomassa pode ser perdida nas etapas de lavagem. Já o método de filtração é mais caro, pois os filtros não podem ser reutilizados, mas é possível trabalhar com menores volumes. O entupimento dos filtros se o caldo for viscoso ou se a densidade celular estiver muito elevada é uma importante limitação desse método. Outra técnica utilizada é a contagem de células, que pode ser realizada por plaqueamento em meios semissólidos para contagem de colônias, ou através da observação em microscópio. Em geral, essa técnica requer etapas prévias de diluição e desagregação no caso de células que formam grumos. É trabalhosa e nem sempre todas as células vivas presente na amostra formarão colônias em placas, além da análise estatística desta técnica ser questionável devido aos desvios normalmente elevados (Sonnleitner et al., 1992). Um excelente método alternativo para análise detalhada da população de células que fornece informações sobre características celulares, como viabilidade, forma e componentes celulares é a citometria de fluxo, que pode analisar de maneira rápida individualmente as células de uma população (Scheper, Lammers, 1994).
A citometria de fluxo é uma técnica de análise celular de parâmetros intrínsecos e extrínsecos baseados na dispersão de luz e sinais de fluorescência e que fornece informações sobre a cultura ao nível de unidades celulares. Primeiramente, a suspensão de células é inserida no citômetro de fluxo e o fluído deste equipamento confina as células em uma corrente única para dispô-las individualmente para a incidência de um feixe de laser, como apresentado na Figura 6. A dispersão de luz ou fluorescência, neste caso na utilização de fluorocromos, é captada pelos detectores e finalmente correlacionada com parâmetros celulares estruturais e funcionais. Sinais de dispersão de luz estão relacionados aos parâmetros intrínsecos das células já que são obtidos sem que as células sejam marcadas com fluorocromo. A fração da dispersão de luz coletada na mesma direção da incidência, de 0 a 10°, é conhecida como FSC, do inglês Forward Scatter, sendo que esta se refere ao tamanho celular, enquanto que a dispersão de luz coletada lateralmente pelas lentes posicionadas a 90° do eixo de incidência do laser refere-se ao SSC, do inglês Side Scatter, que é proporcional a complexidade da célula. Os outros detectores também posicionados a 90°, FL1, FL2 e FL3, que captam a emissão de fluorescência da célula previamente marcada com algum fluorocromo. Existe grande variedade de fluorocromos, assim como várias aplicações em citometria de fluxo. Alguns fluorocromos ligam-se a componentes celulares específicos como ácidos nucleicos, proteínas e lipídios, proporcionando aumento da fluorescência. Alguns acumulam-se em determinados compartimentos celulares, enquanto que outros captam reações enzimáticas celulares específicas, ou são ativados em determinadas condições como alteração de pH, polarização da membrana celular, etc. Além disso, existe a aplicação de anticorpos específicos marcados com fluorocromos, para detectar por exemplo a produção imediata da proteína de interesse. Uma importante característica da técnica de citometria de fluxo é a possibilidade de analisar grande número de partículas em curto espaço de tempo, de 5.000 a 100.000 células por segundo, de acordo com o equipamento, além da possibilidade de análise de múltiplos parâmetros simultaneamente. Esta tecnologia vem sendo aplicada em diferentes áreas como na indústria farmacêutica, de laticínios, de bebidas, tratamento de água, análises ambientais, etc. (Díaz et al., 2010).
Figura 6 – Esquema de um citômetro de fluxo.
(1) presença do fluído para formação de uma corrente única de células; (2) incidência do feixe de luz laser nas células individualmente, emitindo diferentes sinais relacionados à diversos parâmetros celulares; (3) dispersão da luz e emissão de fluorescência de cada partícula são detectadas pelo sistema óptico composto por filtros e espelhos; (4) sinais são coletados pelo sistema de detecção FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 e por fim os sinais são enviados ao computador para representação da distribuição da população em relação aos diferentes parâmetros avaliados. Fonte: Modificado de Díaz et al.(2010).
O uso de fluorocromos para marcação de células obtidas em bioprocessos para análise por citometria de fluxo pode ser exemplificada por Hewitt et al. (2000), que realizaram cultivos descontínuos alimentados de Escherichia coli em alta densidade celular e evidenciaram mudança progressiva na fisiologia das células ao longo do cultivo devido a alterações no ambiente, no caso diferentes concentrações de glicose e oxigênio dissolvido. Estas modificações foram observadas com o uso de um fluorocromo que internaliza células com membrana citoplasmática despolarizada e outro que marca células com membrana permeabilizada. Além disso, os autores compararam cultivos em pequena e grande escala, 5 e 20.000 L respectivamente, e mostraram que no maior reator, que não foi homogeneizado apropriadamente, obtiveram menor concentração de biomassa mas com maior quantidade de células viáveis, enquanto que no reator de pequena escala, maior concentração de biomassa, porém menor quantidade de células viáveis, evidenciando que a técnica de citometria de fluxo
pode ser uma importante ferramenta no estudo do escalonamento de cultivos, e esta alteração na escala pode resultar em células com diferentes condições fisiológicas, além de sugerir que a análise apenas da biomassa não reflita a obtenção do produto de interesse, já que apenas células viáveis são capazes de produzi-lo (Hewitt et al., 2000).
Portanto, a técnica de citometria de fluxo apresenta características que suportam sua utilização para análise de bioprocessos e que podem contornar os problemas apresentados pelas técnicas convencionais de análise de biomassa.