Os cultivos do processo contínuo com reciclo de células condição 4 alcançaram a maior DO entre todos os processos, assim como a maior massa seca no reator. O valor de DO máx. foi 3 vezes maior do que o alcançado no processo descontínuo, 2 vezes maior do que o do descontínuo alimentado e 5 vezes maior que o obtido no processo descontínuo realizado em escala de 60 L, que foi interrompido com DO de aproximadamente 6 para coleta das células e produção da vacina (Gonçalves et al., 2014). O processo descontínuo realizado neste trabalho foi melhor do que o processo descontínuo realizado em 60 L, pois as células foram coletadas na DO máxima de crescimento, o que resultou em densidade celular 1,5 vezes
maior. Porém, quando comparado com outras bactérias do mesmo gênero, a proporção de aumento da biomassa entre os processos descontínuo e contínuo com reciclo de células foi menor neste trabalho, por exemplo, Holst et al. (1985) obtiveram um aumento de 11 vezes na produção de massa seca de Streptococcus lactis no processo contínuo com reciclo em relação ao descontínuo, atingindo a concentração de 18,9 g/L, e Taniguchi et al. (1987) conseguiram um aumento de 35 vezes na produção de massa seca (calculada a partir da medida de DO) de
Streptococcus cremoris .
No entanto, quando comparada a viabilidade entre os três processos realizados observa-se que não houve diferença estatística entre os processos descontínuo e descontínuo alimentado (P = 0,3530) e a condição 4 de reciclo apresentou diferença estatística em relação aos processos descontínuos (P = 0,0150). É possível observar ainda na Tabela 14 que a viabilidade celular das condições 1, 2 e 3 do processo contínuo com reciclo foram similares às obtidas nos processos descontínuos. As similaridades observadas na viabilidade dos diferentes processos devem-se à imprecisão do método de diluição seriada de bactérias e posterior plaqueamento, sugerindo que esta técnica não é apropriada para detectar pequenas diferenças entre os cultivos, além de ser de difícil execução e sem resultados imediatos. Isto indica a necessidade do estudo de outras técnicas que permitam determinar imediatamente quando cessa o crescimento celular para que então o cultivo seja interrompido e as células coletadas ainda vivas. Uma possível estratégia para isso seria o uso da citometria de fluxo, que vem sendo aplicada para o estudo de bioprocessos por alguns grupos. Resultados imediatos de viabilidade das bactérias presentes no reator poderiam ser obtidos utilizando diferentes fluorocromos que diferenciam células mortas de células vivas (Díaz et al., 2010).
O processo descontínuo alimentado apresentou maior DO que o descontínuo, cerca de 1,5 vezes maior, no entanto, não apresentou maior massa seca como seria esperado, pois a correlação massa seca x DO foi diferente para os dois processos, que será discutido adiante. A concentração de biomassa máxima medida pelo método da massa seca (X máx.) para os 3
processos fermentativos não apresentou as mesmas proporções de aumento verificadas para DO máx. Para o processo contínuo com reciclo, os valores de X máx. variaram segundo a
condição de cultivo empregada e foram superiores aos dois processos descontínuos, a condição 4 de cultivo foi cerca de 2,5 vezes maior do que os valores obtidos nos processos descontínuos. Visto que todos os processos contínuos apresentaram maior massa seca e DO que os dois processos descontínuos, pode-se concluir que esta estratégia favoreceu o crescimento de Streptococcus pneumoniae cepa RM200, seja pela adição constante de nutrientes, seja pela remoção dos metabólitos inibitórios do crescimento.
Pode-se observar na Tabela 14 que os cultivos do processo descontínuo alimentado e do processo contínuo com reciclo de células nas condições 3 e 4 tinham glicose presente no reator quando o crescimento celular cessou, portanto outro fator impediu que o crescimento continuasse. Considerando a média dos valores da concentração de lactato no momento de DO máx. de todos os cultivos em que ainda havia glicose disponível no reator quando o crescimento cessou, poderia se inferir que a concentração inibitória do crescimento de
Streptococcus pneumoniae cepa RM200 seria 22,4 ± 2,2 g/L de lactato. Portanto, esta
concentração deveria ser evitada para que não houvesse a inibição do crescimento, já que para a produção de uma vacina celular o objetivo é a obtenção da maior biomassa possível. Esta concentração inibitória foi inferior à encontrada por Taniguchi et al. (1987), que mostraram redução da razão µ/µ máx. para Streptococcus cremoris cultivado utilizando o processo
contínuo com reciclo de células quando a concentração de lactato no reator atingiu 22 g/L e nenhum crescimento quando a concentração atingiu 35 g/L.
A velocidade específica máxima de crescimento (µ máx.) foi determinada pela regressão
linear dos dados de ln (DO) em relação ao tempo para todos os cultivos do instante 0 até 3 h, pois os cultivos encontravam-se na fase exponencial. Além disso, não foi observada fase lag ou de transição em nenhum dos cultivos realizados. Como a alimentação no processo descontínuo alimentado e o reciclo no processo contínuo foram realizados sempre após 3 h de cultivo, pode-se afirmar que a fase exponencial de crescimento ocorreu durante a etapa de batelada desses cultivos. Todos os processos apresentaram µ máx. semelhante, sem diferença
estatística entre eles, apesar de o processo descontínuo ter sido realizado com concentração do reagente soytone maior, 2% (m/v), enquanto que para os demais a concentração foi 0,5% (m/v).
Após as análises das concentrações de biomassa e glicose no reator, foram realizados os cálculos dos valores acumulados, ou seja, a massa total do que foi produzida ou consumida para cada cultivo, incluindo o que foi removido do reator durante amostragens ou reciclo. Os valores acumulados foram então empregados para construir as curvas médias em função do tempo dos cultivos de cada processo fermentativo realizado, além da curva de massa seca total produzida em função da glicose consumida (Figura 25), e com base nesta curva calculou-se o coeficiente angular de cada cultivo para determinação do YX/S descrito adiante nesta seção.
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Figura 25 – Comparação da DO, da quantidade total de massa seca produzida e de glicose consumida em função do tempo de cultivo e curva da massa seca produzida em função da glicose consumida nos 3 processos fermentativos realizados para cultivo de Streptococcus pneumoniae cepa RM200.
Os cultivos do processo descontínuo alimentado apresentaram DO similares às do processo descontínuo até 4 h de cultivo, depois a DO de cultivo do processo descontínuo foi ultrapassada, pois neste momento ele encontrava-se entre a fase de declínio da velocidade de crescimento e o início da fase estacionária. Porém, para massa seca, a similaridade foi apenas até 2,5 h de cultivo, depois o processo descontínuo apresentou massa seca superior, no mesmo instante de tempo analisado, quando comparado aos processos descontínuo alimentado e contínuo com reciclo de células até o instante 4,6 h, momento em que o processo contínuo superou o descontínuo, cujo crescimento celular cessou.