Biologie moléculaire :

En cas culture négative du tissu de la poche malgré une des preuves d’infections, on peut avoir recours à une incubation prolongée, ou recourir à l’amplification et au séquençage des gènes de l’ARN ribosomal 16s pour la détection de bactéries atypiques.

L'identification par technique de biologie moléculaire des staphylocoques, plus ou moins associée à la détection de la résistance à la méticilline, est désormais largement répandue. Ces techniques sont applicables directement à partir des prélèvements, qu'ils soient mono- ou polymicrobiens, d'hémocultures positives, ou de culture pure.

L'amplification peut être réalisée par PCR point final ou par PCR en temps réel. La cible amplifiée dépendra de la spécificité souhaitée.

2.6. Antibiorésistance :

2.6.1. Résistance des staphylocoques

Résistance à la pénicilline :

Près de 87 % des souches de staphylocoques résistent à la pénicilline G par production de pénicillinases extracellulaires, inductibles et codées par des plasmides.

Elles inactivent les pénicillines G et V, les aminopénicillines, les carboxypénicillines et les uréidopénicillines. En revanche, elles ont peu d'affinité pour la méticilline, l'oxacilline, la

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cloxacilline, les céphalosporines, les carbapénèmes, et elles sont inhibées par l'acide clavulanique.

Résistance à la méticilline chez S. aureus :

Environ 20 % des souches hospitalières de S. aureus sont résistantes à la méticilline (SARM). Les SARM hébergent généralement le gène mecA qui code pour une protéine liant la pénicilline additionnelle (PLP2a), de faible affinité, responsable de la résistance intrinsèque à toutes les β-lactamines, ainsi qu'aux inhibiteurs des β-lactamases, à l'exception de nouvelles céphalosporines actives sur les SARM récemment mises sur le marché (ceftaroline, ceftobiprole). Un variant de mecA, nommé mecC, a été décrit en 2011 chez S. aureus et est également responsable de résistance à la méticilline (PLP2c additionnelle).

L'expression phénotypique de la résistance à la méticilline peut être homogène (l'ensemble de la population apparaît résistante) ou hétérogène (une fraction plus ou moins importante de la population apparaît résistante). Par la méthode de diffusion, la recherche de la méticillinorésistance s'effectue à l'aide d'un disque de céfoxitine (30 μg) dans les conditions standard de l'antibiogramme. Les souches de S. aureus présentant un diamètre supérieur ou égal à 25 mm sont sensibles ; celles ayant un diamètre strictement inférieur à 22 mm sont résistantes. Entre les deux bornes, il est nécessaire de rechercher la présence des gènes mecA/mecC par PCR ou l'expression d'une PLP additionnelle (PLP2a, PLP2c) après induction par une β-lactamine.

Des tests immunologiques utilisant des anticorps monoclonaux dirigés contre la PLP2a ont été développés pour détecter la résistance à la méticilline directement à partir de culture primaire de S. aureus, permettant de raccourcir le délai de réponse de 24 heures par rapport à l'antibiogramme classique.

La PLP2a peut être recherchée par des techniques d'agglutinations avec des particules de latex sensibilisées ou par test immunochromatographique, plus sensible et plus spécifique.

Il est à noter que deux autres mécanismes peuvent être à l'origine d'une sensibilité diminuée de souches de S. aureus à l'oxacilline mais ils restent marginaux. Ces deux mécanismes

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sont l'hyperproduction constitutive de la pénicillinase plasmidique (souches dites BORSA, pour borderline oxacillin-resistant S. aureus) et la modification de l'affinité ou l'expression des PLP naturelles de S. aureus (souches dites MODSA, pour modified PBP S. aureus).

Résistances aux glycopeptides :

Depuis les années 1980, des souches de staphylocoques à coagulase négative de sensibilité diminuée aux glycopeptides ont été décrites. Au cours des années 1990, ont également été rapportées les premières souches de S. aureus de sensibilité diminuée. Pour S. aureus, les phénotypes de résistance suivants sont décrits :

■ résistance homogène (GISA, glycopeptide-intermediate S. aureus), pour laquelle les CMI de la vancomycine et de la teicoplanine sont strictement supérieures à 2 mg/l ;

■ résistance hétérogène (hGISA, heterogeneous GISA) pour laquelle les CMI de la vancomycine et de la teicoplanine sont inférieures ou égales à 2 mg/l alors que la souche héberge une sous-population résistante, capable de croître en présence de vancomycine à des concentrations supérieures à 2 mg/l.

Résistance aux aminosides :

Elle est principalement liée à l'acquisition via des transposons ou des plasmides d'enzymes inactivant ces antibiotiques. Trois phénotypes de résistance majeurs peuvent être retrouvés : résistance à l'amikacine et la kanamycine (phénotype « K » lié à une aminoside 3′-phosphotransférase), résistance à l'amikacine, la kanamycine et la tobramycine (phénotype « KT » lié à une aminoside adényltransférase) et résistance à l'amikacine, la kanamycine, la tobramycine et la gentamicine (phénotype « KTG », lié à une enzyme bifonctionnelle aminoside 6′-acétyltransférase et aminoside 2″-phosphotransférase).

2.6.2. Résistances des streptocoques et entérocoques

Résistance aux betalactamines :

Les streptocoques sont naturellement sensibles aux β-lactamines, à l'exception des monobactames actifs uniquement sur les bactéries à Gram négatif. Les streptocoques β-hémolytiques, comme S. pyogenes et S. dysgalactiae, sont très sensibles aux pénicillines. Les

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concentrations minimales inhibitrices (CMI) des pénicillines G (benzylpénicilline) et A (amoxicilline) sont inférieures ou égales à 0,01 mg/l. Les CMI pour S. agalactiae sont habituellement plus élevées (CMI médiane ou modale = 0,06 mg/l). La résistance acquise liée à la modification des protéines liant les pénicillines (PLP) par transformation et par recombinaison homologue entre espèces proches est fréquente chez les streptocoques oraux, en particulier chez S. pneumoniae et les streptocoques du groupe mitis. Elle entraîne une résistance croisée à l'ensemble des β-lactamines et l'activité des molécules utilisées en thérapeutique (amoxicilline, ceftriaxone, céfotaxime ou imipénème le plus souvent) doit être confirmée par la mesure des CMI.

Les entérocoques sont naturellement plus résistants aux antibiotiques, notamment aux β-lactamines, que les streptocoques.

La présence d'une PLP5 de faible affinité pour les β-lactamines entraîne une résistance aux céphalosporines et une augmentation des valeurs de CMI des pénicillines d'un facteur 10 à 100 par rapport aux CMI de ces antibiotiques pour les streptocoques. En pratique, l'ampicilline ou l'amoxicilline constituent des molécules de choix pour le traitement des infections à E. faecalis. En revanche, les souches d'E. faecium sont fréquemment résistantes à l'amoxicilline par modification de la PLP5.

Résistance aux aminosides :

Les streptocoques et les entérocoques, du fait de leur métabolisme anaérobie et du caractère incomplet de leur chaîne respiratoire, sont naturellement résistants à bas niveau aux aminosides par défaut de transport actif de l'antibiotique.

En l'absence de mécanisme acquis conférant une résistance à haut niveau, l'association avec les antibiotiques actifs sur la synthèse de la paroi (β-lactamines et glycopeptides) est synergique et augmente l'effet bactéricide.

Résistance aux macrolides, lincosamides et streptogramines :

Les streptocoques sont naturellement sensibles aux macrolides, lincosamides et streptogramines. Cependant, de nombreux mécanismes de résistance acquise, de fréquence variable en fonction des espèces et de l'origine géographique des souches, sont décrits.

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E. faecalis présente une résistance naturelle aux lincosamides et aux streptogramines du fait

d'une résistance au facteur A de la streptogramine, ce qui constitue une aide à l'identification de cette espèce. Ce type de résistance naturelle est également présent pour d'autres espèces d'entérocoques : E. avium, E. gallinarum et E. casseliflavus.

En revanche, E. faecium, E. durans et E. hirae sont sensibles aux lincosamides et aux streptogramines A. Des résistances acquises similaires à celles observées pour les streptocoques peuvent être observées.