• Aucun résultat trouvé

CHAPITRE 1. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

I. L ES BIOFILMS D ' EAU DOUCE OU PERIPHYTON

2. Le périphyton comme marqueur d'une contamination

2.2 Biodescripteurs du périphyton

Dans le cadre de l'utilisation du périphyton comme bioindicateur de la contamination chimique, deux niveaux de réponse biologique peuvent être étudiés : une réponse en termes de perturbation de la structure de la communauté, et une réponse en termes de perturbation des fonctions qu'elle exerce dans l'écosystème.

2.2.1 Modifications de structure

L’information la plus basique que l’on peut obtenir sur une communauté périphytique est une mesure de biomasse (Aloi 1990). La biomasse est classiquement estimée par unité de surface colonisée par le biofilm. On peut évaluer la biomasse par différentes méthodes dont les plus communes sont une mesure du poids sec ou dry weight (DW), que l'on obtient par filtration, et une mesure des matières volatiles (matières organiques) ou masse sèche sans cendre, soit Ash Free Dry Weight (AFDW), que l’on obtient par combustion d'un filtre ou d'une quantité donnée de matière dans un four à moufle (500 °C). La mesure d'AFDW permet d'estimer la quantité de matières organiques contenues dans le biofilm, c'est/à/dire à la fois la matière vivante, et la MO issue de débris cellulaires ou détritus accumulés dans la matrice en provenance de la rivière. Le poids sec permet d'estimer la quantité de matière contenue dans le biofilm, ce qui prend aussi en compte des débris ou détritus charriés par la rivière. Ces deux mesures ne permettent donc pas d'estimer la biomasse réelle d'un biofilm.

La biomasse algale est en général évaluée par une mesure de la concentration en chlorophylle a. L'estimation ainsi faite n'est néanmoins pas toujours idéale pour évaluer la quantité d'algues, puisque la concentration en chlorophylle dans les cellules algales peut varier selon certains paramètres comme la lumière (Burns & Ryder 2001). La mesure de la concentration en chlorophylle a permet aussi de calculer l'indice autotrophe (autotrophic index ou AI) que l'on définit comme le ratio de AFDW sur la concentration en chlorophylle a. Les valeurs

CemOA

: archive

ouverte

d'Irstea

standards évoluent généralement entre 50 et 2006 (Azim & Asaeda 2005), les faibles valeurs correspondant à des communautés plutôt autotrophes. Ainsi, Paule et al. (2009) obtiennent des valeurs comprises entre 42 et 258 pour des biofilms prélevés in situ, les valeurs les plus élevées étant obtenues pour les biofilms plus âgés (valeurs inférieures à 100 pour des biofilms collectés après 5 semaines et demie de colonisation, et supérieures à 150 pour des biofilms prélevés après seulement trois semaines de colonisation). Par ailleurs, l'estimation de la biomasse algale peut être affinée par des mesures de biovolumes (Burns & Ryder 2001).

La biomasse peut aussi être estimée à partir de la composition élémentaire du biofilm, c'est/à/dire la composition en carbone, azote et phosphore, voire les ratios C/N, C/P ou encore N/P. Par exemple, le ratio C/N est habituellement utilisé comme indicateur de la quantité protéique (densité de cellules algales et bactériennes) : une grande quantité protéique (haute concentration en azote donc ratio C/N faible) correspond à un biofilm composé de cellules en division rapide, soit plutôt des bactéries, diatomées et cyanobactéries (McMahon et al. 1974), donc un biofilm a priori plutôt mature (Romani et al. 2004a). Ces mesures simples de biomasse sont utilisées communément et ont permis, dans certaines études, de mettre en évidence des perturbations liées à la présence de substances toxiques dans le milieu comme des herbicides ou des métaux (Sabater et al. 2007).

Enfin, pour détailler l'impact d'une perturbation, deux approches taxonomiques par observation et comptage au microscope ont souvent été employées, en général sur les algues.

La première approche consiste à analyser la présence d'un type de micro/organisme particulier. Les diatomées, notamment, ont fait l'objet de nombreuses études taxonomiques sur périphyton. En effet, elles sont le genre taxonomique le plus représenté dans la majorité des cas ; il est, de plus, possible de les identifier par leur taille et la forme de leur frustule, à savoir leur squelette de silice (Morin 2006). Les densités des différents taxons identifiés peuvent être comparées, par exemple sur des sites de prélèvement différents. Ainsi, plusieurs indices basés sur la composition taxonomique des communautés de diatomées ont été développés, par exemple l'Indice Biologique Diatomique ou IBD (NF T 90 354). Certaines études ont montré que les indices diatomées étaient effectivement plus faibles sur des sites impactés par des herbicides ou des métaux (Dorigo et al. 2004; Sabater 2000). Cependant, ces indices reposent sur les preferenda écologiques des espèces de diatomées répertoriées : ils permettent, de ce fait, d'identifier différents niveaux de charge organique et ionique des cours d'eau, sans pour autant prendre en compte la contamination chimique du milieu. Ainsi, certaines diatomées sont considérées pour le calcul de l'IBD comme indicatrices d'une bonne qualité de l'eau, mais sont aussi observées sur des sites fortement contaminés par des métaux (Morin 2006). Plus simplement, une diminution de la

CemOA

: archive

ouverte

d'Irstea

densité cellulaire des diatomées peut être le signe d'une perturbation par un élément toxique (Sabater et al. 2007).

Une seconde approche consiste à intégrer la présence (ou l'absence) de toutes les algues identifiables pour calculer des indices de similarité, comme l'indice de Sorensen (Gustavson & Wängberg 1995), ou de dissimilarité comme l'indice de Bray/Curtis (Seguin et al. 2002a), voire des indices de diversité, comme l'indice de Shannon (Guasch et al. 1997; Serra et al. 2009a). Ces indices permettent de comparer la diversité ou l'évolution de la structure de communautés périphytiques prélevées dans un gradient de contamination ou exposées à différents niveaux de concentrations en agent toxique. Les indices peuvent aussi être calculés en considérant une classe d'algues particulière : par exemple, Serra et al. (2009a) évaluent la diversité en diatomées de périphyton exposé au cuivre par calcul de l'indice de Shannon après identification des diatomées au microscope. Ils observent une augmentation de la diversité taxonomique des communautés exposées au cuivre : en effet, les communautés adaptées au laboratoire sont dominées par une espèce de diatomée – A. minutissima – très sensible au métal. La présence de cuivre engendre la disparition de cette espèce et par conséquent l'augmentation de l'abondance relative des autres espèces de la communauté.

A de fortes contaminations, il est aussi possible d'observer des effets de déformation morphologique sous l'effet du stress toxique, par exemple chez certaines espèces de diatomées (Morin et al. 2008a; Sabater et al. 2007).

Plus récemment, de nouvelles techniques permettant d'éviter le comptage et l'identification par microscopie, étapes longues et fastidieuses d'une approche taxonomique, ont été développées. On peut par exemple citer l'utilisation des fluorimètres de type PAM (Pulse Amplified Modulation) qui permettent, par déconvolution du signal fluorescent émis par des communautés algales complexes, d'évaluer la répartition en chlorophycées (algues vertes), diatomées (algues brunes) et cyanobactéries (algues bleues). En effet, chaque classe algale possède une composition de pigments photosynthétiques et donc un spectre d'excitation spécifiques. En excitant les algues par un signal lumineux à 4 longueurs d'onde différentes (470, 520, 645, 665 nm), il est possible de quantifier les abondances relatives de chaque classe algale, les spectres d'excitation de chacune étant connus7 (Barranguet et al. 2004). Par exemple Serra & Guasch (2009) observent, sur des communautés exposées au cuivre, une augmentation de la proportion en algues vertes et une diminution de la proportion en algues brunes (diatomées), par comparaison avec une communauté témoin, les algues bleues n'étant pas impactées par le métal.

7Des spectres de référence pour chaque classe algale, utilisables pour quantifier leur abondance relative dans des échantillons de périphyton, ont été déterminés sur des cultures pures, et validés (Schmitt/Jansen & Altenburger 2008). CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

Les fluorimètres de type PAM permettent aussi de quantifier la biomasse algale totale ; la technique est sensible puisqu'elle permet de détecter des concentrations faibles en chlorophylle (0.1 Ug/cm2). Cependant, le signal fluorescent est perturbé pour des biofilms épais ou matures contenant de grandes quantités de débris cellulaires, acides humiques et produits de dégradation des pigments photosynthétiques, ce qui rend la mesure peu fiable pour ce type de communautés (Schmitt/Jansen & Altenburger 2008)8. Il est aussi possible de déterminer la composition en pigments algaux par analyse HPLC, pour en déduire la composition en grands groupes algaux (diatomées, algues vertes et cyanobactéries) (Sabater et al. 2007). Cette technique a par exemple été utilisée par Dorigo et al. (2007) : ils ont pu mettre en évidence une évolution des communautés algales de biofilms prélevés in situ le long d'un gradient de contamination aux pesticides. Ces méthodes permettent d'identifier des modifications de la structure des communautés algales de manière beaucoup plus fine que les mesures grossières et globales de biomasse citées ci/dessus (poids sec, AFDW et concentration en chlorophylle a).

En ce qui concerne la biomasse bactérienne périphytique, elle peut être mesurée par comptage des bactéries par microscopie à épifluorescence, avec éventuellement distinction entre les bactéries vivantes et les bactéries mortes par utilisation de marqueurs fluorescents (Thomas et al. 2006). La biomasse fongique peut aussi être évaluée par extraction et dosage de l'ergostérol, un lipide membranaire caractéristique des espèces fongiques (Francoeur et al. 2006). En revanche, il est difficile, voire impossible, de distinguer les différentes classes de bactéries par microscopie car elles sont morphologiquement peu reconnaissables. Enfin, les techniques de biologie moléculaire récemment développées permettent d'estimer la diversité microbienne ou fongique par fingerprinting, voire d'identifier les grands groupes bactériens par la technique FISH (partie III de ce chapitre).

2.2.2 Approches métaboliques et physiologiques

Les perturbations fonctionnelles du périphyton sont en général étudiées par des mesures d'activité métabolique qui permettent pour certaines de distinguer les autotrophes (mesure de la photosynthèse) des hétérotrophes (activités enzymatiques par exemple), voire certains types de micro/organismes (par exemple ceux réalisant la nitrification). L'activité photosynthétique ou la respiration peuvent être mesurées par des changements de pH ou de concentration en oxygène et/ou CO2, par exemple dans des bouteilles hermétiques contenant le périphyton (méthode light and dark bottles ou méthode des bouteilles sombres et claires, Wetzel & Likens 1991). Des substrats radioactifs (carbonates marqués au 14C pour la photosynthèse ou thymidine marquée au

CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

14C pour l'activité bactérienne) sont aussi couramment utilisés. Enfin, les fluorimètres de type PAM ont été utilisés pour mettre en évidence des perturbations de la photosynthèse par des herbicides (Schmitt/Jansen & Altenburger 2008). Ces fluorimètres permettent en effet de mesurer un rendement photosynthétique (ou efficacité photosynthétique, qui traduit la transformation de l'énergie lumineuse en énergie chimique au niveau du photosystème II) en soumettant les communautés à des pulses de lumière. Les fluorimètres PAM sont néanmoins peu adaptés pour évaluer l'impact sur des communautés algales d'agents toxiques n'agissant pas directement sur la fonction photosynthétique, pour lesquels des mesures physiologiques moins spécifiques (par exemple la respiration, etc.) sont préférables (Sabater et al. 2007).

Les activités enzymatiques extracellulaires, bien que potentiellement pertinentes pour étudier l'effet d'une perturbation sur la communauté hétérotrophe (Sabater et al. 2007), sont encore relativement peu utilisées dans le cadre d'études sur les effets des composés toxiques. Elles sont pourtant largement employées pour étudier les mécanismes de bio/dégradation de la matière organique en milieu aquatique (Sinsabaugh et al. 1997; Sinsabaugh & Foreman 2001). On peut citer néanmoins l'activité phosphatase qui diminue par exemple sur du périphyton exposé au Zn (Paulsson et al. 2002; 2000). La toxicité du Cu a aussi été mise en évidence sur périphyton au moyen de plaques de culture BIOLOG : d'abord développées pour l'identification de souches bactériennes à partir de leur profil d'utilisation de substrats carbonés, ces plaques de culture, contenant 95 substrats différents, permettent en effet de mettre en évidence des perturbations physiologiques, par exemple sous l'effet d'un agent toxique (Boivin et al. 2006; 2005).

Les deux types d'approche, fonctionnelle et structurelle, permettent de mettre en évidence les effets d'une perturbation sur les communautés périphytiques. Elles se complètent car il est toujours possible que des modifications en termes de fonctionnement ne se traduisent pas en termes de changement de structure du périphyton : il peut y avoir, par exemple, des phénomènes d'adaptation. Réciproquement, une modification de la structure peut ne pas se traduire en termes fonctionnels pour la communauté. Par exemple, Serra & Guasch (2009) mesurent un même rendement photosynthétique sur deux biofilms, dont l'un seulement est cultivé en présence de cuivre. Cependant, l'analyse de la composition de ces deux communautés montre qu'elles sont différentes, la communauté exposée au cuivre ayant une proportion beaucoup plus élevée en algues vertes et beaucoup plus faible en diatomées. Des approches complémentaires structure/fonction sont donc a priori nécessaires pour évaluer l'impact d'une perturbation. CemOA : archive ouverte d'Irstea / Cemagref

2.3 Conclusion sur l'utilisation des biofilms pour