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CHAPITRE 1. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

III. L’ARISA POUR EXPLORER LA DIVERSITE GENETIQUE DES BIOFILMS

3. Principe et utilisation de l'ARISA

3.1 L’ARISA : exploitation du polymorphisme de taille des intergènes

3.1.1 ARISA Bactérie

La technique RISA (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) ou sa version automatisée plus récente : l’ARISA (Automated RISA) repose sur le polymorphisme de taille de l’intergène (IGS ou Intergenic Spacer) situé entre les gènes codant pour les ARN ribosomaux 16S et 23S des bactéries. Les amorces de PCR utilisées sont donc en général choisies sur des zones conservées des gènes 16S et 23S (Figure 16).

Selon les organismes, on considère globalement que la taille de ce fragment d’ADN varie de 150 à 1500 bp environ (Ranjard et al. 2000a), sachant qu'il n'existe pas de corrélation entre le genre (ou l'espèce) et la taille de l'IGS correspondant. Les IGS amplifiés sont séparés sur un gel d’agarose ou de polyacrylamide suivant leur taille. La grande variabilité de taille de l’IGS permet de mettre en évidence de petites modifications dans la structure génétique et de ce fait de distinguer des espèces très proches phylogénétiquement (García/Martínez et al. 1999; Spiegelman

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et al. 2005). L'utilisation d'une amorce marquée par fluorescence a rapidement permis l'automatisation de la méthode (Fisher & Triplett 1999).

Figure 16 : Position sur les gènes 16S et 23S de trois sets d'amorces PCR couramment utilisés pour l'ARISA sur

des communautés bactériennes. Le nombre de nucléotides des gènes 16S et 23S amplifiés par PCR sont indiqués avec les doubles-flèches. A : ITSF/ITSReub. B : SD-Bact/LD-Bact. C : 10406F/23Sr. (Cardinale et al. 2004).

La banque de données de séquences d’IGS disponibles est encore trop pauvre pour permettre une identification rapide et efficace des micro/organismes étudiés à partir des seuls IGS : en avril 2010, une recherche dans la base de données Genbank du NCBI donne 26 504 résultats pour une recherche ciblée sur l'intergène 16S/23S chez les bactéries10, et 2 010 399 résultats pour une recherche sur le 16S chez les bactéries11. Si les amorces utilisées pour la PCR permettent d’amplifier, outre l'IGS, tout ou une partie du gène 16S une analyse encore plus fine basée sur l’identification taxonomique des bactéries présentes est possible (Brown et al. 2005). Cependant, ce type d’approche est encore peu utilisé.

L'ARISA est majoritairement utilisée pour étudier les communautés bactériennes, mais certaines études mettent à profit le polymorphisme de taille de la région 16S/23S chez les cyanobactéries (Wood et al. 2008) ou chez certains eucaryotes (voir ci/dessous), ou encore sur des communautés d'archées (Leuko et al. 2007; Qu et al. 2009).

3.1.2 ARISA Eucaryote

Chez les eucaryotes, l’ARISA exploite le polymorphisme de taille de la région située entre les gènes codant pour le 18S et le 28S, qui contient deux intergènes ITS1 et ITS2 de taille variable (Figure 14 et Figure 17). Ainsi, Ranjard et al. (2001) exploitent la région entière ITS1/5.8S/ITS2, dont la taille varie entre 300 et 1100 bp environ dans leurs échantillons, pour explorer la diversité génétique de communautés fongiques du sol avec l’ARISA. L'ARISA est cependant encore peu

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exploitée pour étudier les communautés eucaryotes, les séquences d'ITS étant surtout utilisées dans le cadre d'études phylogénétiques (Álvarez & Wendel 2003). Les amorces utilisées pour amplifier la région ITS1/5.8S/ITS2 des Fungi sont classiquement celles définies par White et al. (1990), en particulier les amorces "ITS1" et "ITS4" (Figure 17) ou des amorces très proches de celles/ci (Ranjard et al. 2001; Sequerra et al. 1997). Ces amorces sont utilisées pour les échantillons contenant des espèces fongiques dans le cadre des quelques rares études faisant intervenir des techniques de fingerprinting (ARISA ou T/RFLP (Klamer et al. 1997)). Elles permettent surtout l'exploitation de la région ITS1/5.8S/ITS2 dans des études phylogénétiques et sont parfois même remplacées par des amorces plus spécifiques de certaines espèces de Fungi (par exemple, "ITS1F" est spécifique des basidiomycètes (Larena et al. 1999)), voire moins sujettes à co/amplifier des espèces végétales (Larena et al. 1999; Martin & Rygiewicz 2005).

Figure 17 : Schéma représentant la région ITS1-5.8S-ITS2 chez les eucaryotes. Les flèches représentent des

amorces utilisées pour amplifier l'ensemble de la région ou une partie seulement (ITS1 ou ITS2) et leur emplacement sur le 18S, 5.8S ou 28S (Larena et al. 1999).

En ce qui concerne les espèces végétales, il existe des exemples d'exploitation de la région ITS1/5.8S/ITS2, en général dans le cadre d'études phylogénétiques ciblant certaines espèces de diatomées. Par exemple Behnke et al. (2004) utilisent les amorces universelles "fungi" NS1 et ITS4 (White et al. 1990) pour amplifier la région ITS1/5.8S/ITS2 de souches de diatomées Sellaphora pupula, et Beszteri et al. (2005) utilisent aussi les amorces de White et al. (1990) pour amplifier la même région chez des souches de diatomées Cyclotella meneghiniana. Enfin, Marchetti et al. (2008) construisent des amorces eucaryotes pour amplifier l'ITS1 de diatomées Pseudo nitzschia isolées à partir de phytoplancton marin et utilisent une ARISA basée sur les séquences d'ITS1 pour comparer des échantillons prélevés sur des sites différents.

3.2 Applications

La technique RISA a d'abord été développée sur des communautés microbiennes du sol (Borneman & Triplett 1997). Sa version automatisée, l'ARISA, développée par Fisher et Triplett (1999), a été utilisée sur des communautés bactériennes en eau douce (Arias et al. 2006; Jones et al. 2007; Maron et al. 2007; Newton et al. 2006; Yannarell et al. 2003; Yannarell & Triplett 2004), en milieu marin (Brown et al. 2005; Danovaro et al. 2006; Hewson et al. 2006), ou sur des

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communautés microbiennes du sol et des sédiments (Cardinale et al. 2004; Cherif et al. 2007; Danovaro et al. 2006; Ranjard et al. 2001; Sigler et al. 2002; Sigler & Zeyer 2002), des biofilms en milieu marin (Hernandez/Raquet et al. 2006) et en eau douce (Lear et al. 2008; Lear & Lewis 2009a; Lear & Lewis 2009b) et des communautés microbiennes de la rhizosphère (Robleto et al. 1998) ou du compost (Schloss et al. 2003). Des amorces universelles ciblant les bactéries ont donc été optimisées et testées sur des communautés diverses (Cardinale et al. 2004).

L'ARISA est considérée comme une des techniques les plus rapides et les plus appropriées pour explorer la diversité taxonomique de communautés complexes, en particulier lorsqu'il s'agit de comparer entre eux un grand nombre d'échantillons. Ainsi, Cherif et al. (2007) comparent les techniques ARISA et DGGE sur des communautés bactériennes prélevées dans un sol agricole et concluent que l'ARISA est une technique plus facile à mettre en œuvre et moins onéreuse en temps que la DGGE, qui nécessite notamment une optimisation du gradient dénaturant laborieuse (Ranjard et al. 2000c).

L'ARISA permet effectivement de détecter des effets structurels sur des populations bactériennes, par exemple lors d'une exposition à des métaux comme le cadmium et le mercure (Maron et al. 2007; Ranjard et al. 2000b), au cours des saisons (Yannarell et al. 2003), sous l'influence de fluctuations environnementales (Yannarell & Triplett 2005) ou encore à la suite d'un épisode de déforestation pour des populations microbiennes du sol en Amazonie (Borneman & Triplett 1997). Elle est aussi utilisée pour différencier des populations bactériennes (Lear et al. 2009) ou fongiques (Ranjard et al. 2001; Thakuria et al. 2008) issues de sites différents en fonction de paramètres physico/chimiques caractéristiques de chaque site (Lear et al. 2009).

4. Biais et limites des techniques d'empreinte