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CHAPITRE 1. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

III. L’ARISA POUR EXPLORER LA DIVERSITE GENETIQUE DES BIOFILMS

1. Explorer la diversité biologique

1. 1 Intérêt de l'approche moléculaire

L’étude de la diversité des micro/organismes est un outil majeur pour étudier l'impact de perturbations sur un écosystème. Dans le cadre de l'utilisation de la méthode PICT pour évaluer l'impact d'un agent toxique, il est par exemple très intéressant de pouvoir relier une acquisition de tolérance, mesurée globalement sur l'ensemble d'une communauté exposée, au coût génétique de cette acquisition pour la communauté, c'est/à/dire une perte de biodiversité et donc potentiellement une vulnérabilité plus grande de la communauté modifiée à une perturbation ultérieure.

Les techniques traditionnelles d’isolement et de mise en culture ne permettent pas d'estimer correctement la diversité en micro/organismes. En effet, moins de 0.1% des espèces prélevées in situ sont cultivables (Azam et al. 1983). En plus de la sélection d'une petite fraction / cultivable / des communautés, la mise en culture entraîne des modifications dans leur composition globale, notamment par la sélection des espèces qui se développent le plus rapidement dans le milieu de culture, par exemple celles qui utilisent les substrats carbonés puisque les milieux de culture sont très riches en carbone (Nocker et al. 2007). Ainsi, les différentes contraintes liées à la mise en culture ne permettent pas d'obtenir une vision fiable de la biodiversité microbienne réelle des échantillons. L’observation au microscope permet le comptage des cellules présentes mais, notamment dans le cas des cellules procaryotes, ne permet pas l’identification des espèces, la raison principale étant la simplicité morphologique des cellules microbiennes, qui empêche de distinguer correctement les espèces. En ce qui concerne les eucaryotes, l’identification de groupes taxonomiques est possible, par exemple pour les diatomées comme nous l’avons vu plus haut (partie I de ce chapitre), cependant le décompte et l’identification des cellules algales nécessite l'intervention d’experts formés à la taxonomie, et ne permet pas d'évaluer précisément la diversité algale totale, certaines espèces étant de petite taille et ayant peu de caractéristiques morphologiques distinctes (Stevenson 1996).

Depuis une quinzaine d'années, les approches moléculaires sont venues compléter les approches plus traditionnelles (Figure 13), avec le développement de l'écologie microbienne ou moléculaire. En effet, la biologie moléculaire permet d'estimer de manière plus fine la biodiversité

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de communautés complexes par détection et/ou identification des micro/organismes au moyen de marqueurs moléculaires présents dans l'ensemble des communautés et non pas en se limitant à la seule fraction cultivable (v. Wintzingerode et al. 1997).

Figure 13 : Schéma des différentes techniques de biologie moléculaire utilisées pour explorer la diversité

génétique de communautés aquatiques complexes (Dorigo et al. 2005). DGGE/TGGE : Denaturing/Temperature Gradient Gel Electrophoresis. (A)RISA : (Automated) Ribosomal Intergenic Spacer Analysis. SSCP :

Single-Strand Conformation Polymorphism. RADP : Randomly Amplified Polymorphic DNA. AFLP : Amplified Fragmant Length Polymorphism. (T)-RFLP : (Terminal)-Restriction Fragment Length Polymorphism. ARDRA : Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis. (TSA)-FISH : (Tyramide Signal Amplification)-Fluorescence In Situ Hybridization, FCM : Flow Cytometry. Les techniques de fingerprinting sont détaillées ci-dessous au III.2.2

de ce chapitre.

Parmi les techniques de biologie moléculaire couramment utilisées pour explorer la diversité génétique de communautés aquatiques complexes, on peut distinguer les approches basées sur la réaction d' amplification en chaîne par polymérase (Polymerase Chain Reaction ou PCR) (à gauche dans la Figure 13) des autres (à droite dans la Figure 13) (Dorigo et al. 2005). Les approches ne nécessitant pas une amplification par PCR se composent d'une part des techniques de marquage des échantillons par hybridation de sondes fluorescentes, et d'autre part de l'hybridation croisée (cross DNA hybridization ou DNA reassociation dans la Figure 13). La première méthode (technique FISH et ses variantes TSA/FISH ou CARD/FISH pour Catalysed Reporter Deposition FISH) est aujourd'hui couramment utilisée par les microbiologistes pour identifier des

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sont identifiées par observation au microscope à épifluorescence, ou parfois par cytométrie de flux (Dorigo et al. 2005). La technique d'hybridation croisée est utilisée par exemple pour comparer deux à deux les ADN totaux extraits de deux communautés par hybridation croisée, après marquage radioactif d'une des communautés. Elle reste compliquée à mettre en œuvre du fait de la nécessité d'obtenir des ADN de bonne qualité, et peu adaptée au cas de communautés présentant un fort taux de similarité génomique (Ranjard et al. 2000c).

Les méthodes basées sur l'amplification de l'ADN par PCR (à gauche dans la Figure 13) sont aujourd'hui les méthodes moléculaires les plus couramment utilisées pour étudier la diversité génétique de communautés environnementales. On distingue parmi celles/ci les techniques d'empreinte génétique ou fingerprinting et le clonage/séquençage. Ce dernier est très performant pour explorer la diversité génétique d'un échantillon, mais long et difficile à mettre en œuvre, et de ce fait peu adapté à l'étude de l'évolution de structures de communautés complexes. En revanche, les techniques de fingerprinting constituent une alternative intéressante du fait de leur robustesse et de leur rapidité d'utilisation, en particulier pour traiter un nombre élevé d'échantillons (Hewson & Fuhrman 2004). Elles sont, de ce fait, particulièrement utiles pour une analyse comparative d'échantillons prélevés sur des sites ou dans des conditions différentes, ou encore pour une analyse dynamique de l'évolution temporelle d'une communauté.

1. 2 Utilisation de l’opéron ribosomique comme outil d’identification

Les ARN ribosomaux (rRNA) sont les marqueurs phylogénétiques les plus couramment utilisés pour l’identification des micro/organismes procaryotes ou eucaryotes (Spiegelman et al. 2005). En effet, les gènes codant pour les ARN ribosomaux sont présents dans toutes les cellules (procaryotes et eucaryotes), ce qui rend leur amplification et exploitation pour des études phylogénétiques plus aisées. Ils sont, de plus, essentiels pour le bon fonctionnement cellulaire, ce qui explique que leur structure soit globalement très conservée au cours de l’évolution. Enfin, ils ont l’avantage de posséder des régions peu conservées dont la variabilité de séquence peut être mise en relation avec une distance phylogénétique entre micro/organismes : ils permettent de distinguer des genres voire des espèces différentes. Les régions conservées ont, en revanche, une vitesse de mutation très lente et permettent de ce fait de différencier facilement les trois domaines du vivant (Bacteria, Eucarya et Archea).

On trouve trois types d’ARN ribosomaux dans les ribosomes : 16S (ou gène rrs), 23S (ou gène rrl) et 5S (ou gène rrf) chez les procaryotes ; 18S, 5.8S et 28S chez les eucaryotes, la terminologie S étant une indication sur la taille de ces gènes, exprimée en vitesse de

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sédimentation (Figure 14). Du fait de la différence de taille de ces ARN, on appelle communément le 16S : la petite sous/unité ribosomale ou SSU (small subunit) et le 23S : la grande sous/unité ribosomale ou LSU (large subunit). Chez les bactéries, les gènes codant pour les ARN ribosomaux sont, dans la majorité des cas, organisés en opérons (opérons rrn) : trois gènes séparés par des espaces (intergènes ou IGS) soumis à des phénomènes de régulation identiques et transcrits simultanément.

Figure 14 : Schéma de l'opéron ribosomal procaryote (d'après García-Martínez et al. 1999) et de la région

18S-5.8S-28S eucaryote. (d'après Ranjard et al. 2001).

Initialement le gène du 5S a été utilisé pour étudier la diversité microbienne de communautés environnementales, mais sa petite taille (environ 120 nucléotides) en a rapidement limité l’usage pour des études phylogénétiques plus poussées (Spiegelman et al. 2005). Aujourd’hui c’est le 16S (SSU) avec ses quelques 1500 bp qui s’est imposé comme marqueur phylogénétique pour étudier les procaryotes (18S pour les eucaryotes). Les amorces utilisées pour l’amplification des gènes codant pour les ARN ribosomaux peuvent être conçues avec divers degrés de précision taxonomique allant d’amorces universelles, par exemple pour une grande majorité de bactéries présentes dans un échantillon, à des amorces spécifiques d’un domaine phylogénétique voire d’une espèce précise.

Néanmoins les gènes 16S et 18S ne permettent pas une séparation très fine par exemple entre des souches très proches, entre espèces apparentées voire dans certains cas entre genres. Des alternatives plus performantes en termes de résolution génétique existent, parmi lesquelles on peut citer les intergènes dont le polymorphisme de taille est exploité par la technique RISA ou ARISA (Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis). Cependant, les bases de données contenant les séquences des intergènes ou autres alternatives au 16S sont encore relativement peu riches en séquences, ce qui rend leur exploitation plus difficile (Spiegelman et al. 2005). Actuellement, pour identifier une espèce microbienne, la technique la plus simple consiste donc à séquencer le gène 16S et à chercher à identifier des cellules cultivables apparentées, voire à étudier les relations phylogénétiques avec d'autres espèces environnementales.

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