BIOCAPTEUR POUR LA DETECTION DU CATECHOL ET DE LA

DOPAMINE ... 143

A. Construction de l’édifice moléculaire ... 147 B. Détection du catéchol ... 148 1. Mesures par chronoampérométrie... 148 2. Exploitation des résultats ... 149 C. Détection de la dopamine ... 156

1. Mesures par ampérométrie ... 156 2. Interprétation des résultats : ... 157

Le dernier travail présenté au sein de ce manuscrit porte sur l’intégration des nanobâtonnets de disulfure de tungstène dans la conception d’un biocapteur pour la détection du catéchol et de la dopamine.

Le catéchol (CA) est un dérivé répandu du phénol et est largement utilisé dans divers domaines tels que la médecine, les teintures et ou encore la photographie³⁰². C’est pourquoi des traces de ce composé peuvent être trouvées dans l’environnement. Or, le catéchol possède un faible taux de dégradation et est surtout considéré comme un polluant à forte toxicité. En effet, il est très nocif pour le corps humain en raison de sa biotoxicité et des irritations cutanées qu’il peut engendrer303. Ainsi, de nombreuses techniques pour la détection de ce composé ont été développées au cours des dernières années afin de répondre à la demande croissante pour l’obtention d’une méthode fiable de détection du catéchol. Parmi celles-ci, il est possible de retrouver notamment la chromatographie en phase gazeuse³⁰⁴, la chimioluminescence305, la spectrométrie de masse306 ou encore la spectrométrie UV307. Cependant, le coût de ces méthodes, comme vu précédemment, reste élevé et leur réalisation requiert généralement un long laps de temps. C’est pourquoi, par rapport à ces méthodes, l'approche électrochimique présente de nombreux avantages, à savoir l'économie de temps, la simplicité de la manipulation et la baisse du coût de réalisation.

La dopamine (DA) est quant à elle un neurotransmetteur qui joue un rôle important en tant que messager chimique extracellulaire dans les systèmes cardiovasculaire, rénal, hormonal et nerveux. Ainsi, elle est au centre de la transmission du signal cellulaire et a donc une forte influence sur le comportement chez l’homme. De plus, des concentrations anormales de DA dans les fluides biologiques, par exemple l'urine, le plasma sanguin ou encore le liquide extracellulaire du système nerveux central, peuvent être l'indicateur de plusieurs maladies telles que la schizophrénie ou les maladies de Huntington et de Parkinson308,309. La mise au point de techniques de détection permettant une mesure sensible et sélective des concentrations de DA au sein du corps humain est donc très importante pour le diagnostic de ces maladies et le suivi des patients.

En effet, en raison de la concentration de l’ordre du nano-molaire au sein des fluides biologiques310, la détection de la DA nécessite une sensibilité élevée. De plus, les espèces interférentes telles que l'acide ascorbique ou l’acide urique sont très présentes dans les divers fluides corporels, c’est pourquoi une bonne sélectivité est exigée311. Actuellement, la dopamine peut être détectée par différentes méthodes avec notamment l’électrophorèse capillaire³¹², la chromatographie liquide haute performance³¹³, la spectroscopie de masse³¹⁴ et enfin l’électrochimie315,316. Cependant, ces techniques sont souvent coûteuses et lourdes à mettre en place et ne permettent pas à l’heure actuelle un suivi en temps réel de ces maladies neurodégénératives. La conception d’un biocapteur électrochimique sans marqueur, facile d’utilisation et offrant une bonne sensibilité présente un intérêt certain pour la détection de la DA.

Dans cette optique, l’intégration de nanomatériaux dans la réalisation d’un tel dispositif s’avère particulièrement intéressante afin de diminuer le seuil de détection tout en conservant une bonne sensibilité. De plus, ils peuvent être utilisés comme support pour permettre

l’immobilisation du matériel biologique ciblé à travers diverses fonctionnalisations et ainsi assurer une bonne sélectivité par le biais de la reconnaissance entre le biorécepteur et son analyte317,318.

Dans ce travail, un film de WS2 porteur de fonctions acides carboxyliques a ainsi été intégré dans la conception du biocapteur afin de permettre l’immobilisation de la polyphénol oxydase à la surface de l’électrode de carbone vitreux. En effet, la présence de cette fonction va permettre la formation d’une liaison covalente entre la protéine et le film par utilisation d’un intermédiaire réactionnel, conduisant à terme à l’immobilisation de l’enzyme.

La polyphénol oxydase (PPO), ou tyrosinase, est une enzyme capable d’oxyder les groupements phénols et donc les composés tels que le catéchol et la dopamine. Son site actif consiste en une paire d'atomes de cuivre couplés entre eux. Ces atomes de cuivre, CuA et CuB, lesquels sont chacun coordonnés par trois résidus d'histidine, constituent ainsi le site où se déroule l'interaction de la tyrosinase avec l'oxygène moléculaire et son substrat phénolique (Figure 90)319.

A. Construction de l’édifice moléculaire

La première étape de la construction de ce biocapteur consiste donc à déposer le film de de WS2 à la surface de l’électrode pour permettre par la suite l’immobilisation de la PPO.

Pour cela, le film de WS2, obtenu par la filtration de 250 mL d’une suspension de nano-bâtonnets sur un filtre de cellulose, est tout d’abord connecté à la surface de l’électrode de carbone vitreux en utilisant le procédé décrit dans la partie II.B.1. Cette technique conduit ainsi à l’obtention d’un film de WS2-COOH d’une épaisseur de 6,2 µm pouvant être utilisé comme support pour l’immobilisation de protéines.

L’immobilisation est réalisée en suivant le schéma réactionnel présenté au sein de la Figure 91. Ce procédé implique l'utilisation de chlorhydrate de N-(3-diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide (EDC), qui sert ici d’agent d’activation²⁹⁸. L’électrode, recouverte du film de WS2, est premièrement mise en présence d’une solution d’EDC à 20.10-3 mol.L^-1 (PBS pH 7,4) afin de permettre l’activation des groupements acides carboxyliques. La fonction NHS est ensuite introduite par dépôt d’une goutte d’une solution à 10.10-3 mol.L-1 (PBS pH 7,4) à la surface de l’électrode. Celle-ci est laissée à incuber pendant 12 heures à 4°C. Cette étape a pour but de permettre la formation d’un intermédiaire réactionnel sensible aux amines. Enfin, après réaction, l’électrode est rincée à l’aide de la solution tampon avant de procéder à l’incubation de la PPO pendant 12 heures à 4°C par dépôt de 75 µL d’une solution à 0,3 mg.mL-1. La présence de fonctions amines au sein de la protéine va conduire à une réaction d’amidation entre celles-ci et les intermédiaires réactionnels présents à la surface de l’électrode, permettant l’immobilisation de l’enzyme par formation d’une liaison covalente. L’électrode est alors de nouveau rincée à l’aide de la solution tampon avant de procéder aux différentes analyses électrochimiques.

Figure 91: Schéma réactionnel conduisant à l’immobilisation de la polyphénol oxydase à la surface de nanobâtonnets de WS2 fonctionnalisés par des groupements acides carboxyliques.