Forte fréquence de kystes ovariens, chez la souris, suite à l’expression de shRNA ciblant Raptor, protéine régulatrice de mTORC1, dans les cellules bordant l’hypothalamus.
Article en préparation.
• Contexte et objectifs de travail :
La rapamycine est un macrolide aux propriétés antifongiques secrété par Streptomyces hygroscopicus, une bactérie isolée dans des prélèvements de sol de l’Ile de Pâques. Depuis la fin des années 1990, cette molécule (appelé sirolimus ou Rapamune) est prescrite aux individus greffés pour ses propriétés immunosuppressives. Le gène mtor (pour mammalian target of rapamycin) a été identifié comme étant la cible de la rapamycine. La sérine/thréonine kinase mTOR se retrouve dans deux complexes protéiques, mTORC1 et mTORC2, selon les sous unités régulatrices qui les constituent. La protéine Raptor régule mTORC1 et Rictor, mTORC2. L’inhibition de mTOR par la rapamycine s’effectue par la fixation d’un complexe rapamycine/ FKBP12 (immunophiline FK506-binding protein 12). Les premières études ont montré que seul le complexe mTORC1 était inhibé et le complexe mTORC2 était qualifié de rapamycine-résistant. Mais récemment, des études ont montré l’inhibition du complexe mTORC2 lors d’exposition prolongée à cette molécule.
Quelques années après sa mise sur le marché, plusieurs études ont démontré un impact du sirolimus sur la fertilité des patients traités. Chez les hommes, une baisse de testostérone et une augmentation des sécrétions des hormones gonadotropes, LH et FSH, est observée (pour revue : Huyghe et al., 2007). Une baisse de la quantité de sperme et même une absence de spermatozoïdes sont également mises en évidence (Bererhi et al., 2003 ; Skrypek et al., 2007). Chez les femmes, il a été montré une augmentation des épisodes d’oligoménorrhées et d’aménorrhées ainsi que de l’apparition de kystes ovariens chez près de 50 à 60% des patientes (vs 20 à 30% dans le lot contrôle) (Cure et al., 2004). De même, les femmes traitées au sirolimus en cas de maladie autosomique dominante polykystique des reins (ADPKD) présentent une dérégulation de leurs cycles (52% de la cohorte) et une augmentation de l’incidence de kystes ovariens (57%) (Braun et al., 2012 (a)).
Cette dérégulation du système reproducteur peut-elle être imputée à l’inhibition de mTORC1 ? Ce complexe a été identifié dans différents types cellulaires constitutifs de l’ovaire et régule la prolifération des cellules de la granulosa et de la thèque (Kayampilly et al., 2007 ; Palaniappan et al., 2010). Etrangement, peu de travaux se sont intéressés à l’implication de mTORC1 dans la régulation de la reproduction au niveau du système nerveux central. Pourtant le rôle de ce complexe a été mis en évidence dans l’expression du neuropeptide Y, neuropeptide orexigène inhibant les neurones à kisspeptide et GnRH (Shimizu et al., 2010).
Afin de préciser l’implication de mTORC1 au niveau des cellules de l’hypothalamus, nous avons procédé à son inactivation. Nous avons injecté en intracérébroventriculaire des vecteurs lentiviraux exprimant un shRNA ciblant l’expression de la protéine Raptor. La région infectée se situe à l’interface du troisième ventricule et de l’hypothalamus médio-basal.
• Résultats :
Expression des vecteurs lentiviraux, in vitro, dans une lignée de cellules hypothalamiques murines, et, in vivo, dans l’hypothalamus.
Afin d’évaluer l’efficacité de la capacité d’infection des vecteurs lentiviraux, nous avons tout d’abord testé les vecteurs lentiviraux sur une lignée de cellules hypothalamiques murines, la lignée GT1-7. Les cellules sont mises en présence des lentivirus shcontrôle et shRaptor durant 12 heures et sélection en présence de puromycine pendant 24h. Soixante-douze heures après la sélection, les cellules sont congelées ou fixées pour être analysées ultérieurement.
Dans les cellules infectées avec le vecteur lentiviral ciblant l’ARNm de la protéine Raptor, le taux d’ARNm Raptor est réduit (- 90%) en comparaison des cellules shcontrôle (Fig. 1A). Cette observation est reliée à la baisse également observée au niveau protéique dans les cellules shRaptor (Fig. 1B). Cette baisse d’expression de la protéine Raptor est également vérifiée en immunocytochimie, comparée aux cellules shcontrôle (Fig.1C).
In vivo, nous avons pu confirmer l’infection des cellules en bordure du troisième ventricule grâce à l’expression de la protéine fluorescente GFP qui est liée à l’infection et l’intégration du vecteur lentiviral shcontrôle (Fig. 1D). Le marquage en immunofluorescence de la GFP, ici sur une coupe frontale à hauteur du noyau arqué de l’hypothalamus, permet de distinguer les corps cellulaires des cellules infectées en bordure du troisième ventricule et leurs projections dans l’hypothalamus médio-basal et l’éminence médiane. A partir de régions hypothalamiques isolées, nous avons procédé à l’analyse, par RT-PCR quantitative, du taux
d’ARNm de Raptor dans les deux lots de souris. La baisse du taux d’ARNm Raptor n’est pas significativement mise en évidence chez les souris shRaptor par rapport aux souris shcontrôle (Fig. 1E).
Fertilité
L’alternance des différentes phases d’un cycle œstrien représentatif d’une souris shcontrôle et d’une souris shRaptor sont visibles sur la figure 2A. L’analyse des différentes phases de ce cycle chez les souris shRaptor ne montre pas de modification par rapport aux souris shcontrôle (Fig. 2B). Un suivi de la cyclicité avant injection n’a mis en évidence aucune
différence entre les deux lots. De plus, aucune variation entre les lots shcontrôle pré et post-injection et shRaptor pré et post-post-injection n’a été observée.
Le nombre de petits par portée des souris shRaptor n’est pas modifié par rapport aux souris shcontrôle. Cependant, une hausse de 15% est tout de même visible chez les souris shRaptor (Fig. 2C). Cette élévation est corrélée à un plus grand nombre de corps jaunes présents par souris suite à l’analyse histologique des ovaires en œstrus (p=0,0002 ; Fig. 2D).
Au cours de cette analyse histologique, de nombreux kystes ovariens ont été observés chez les souris shRaptor (Fig. 2F). Comme le montre la figure 2E, 44% des souris shRaptor présentent au moins un kyste sur un ovaire (soit chez 4 souris sur 9) alors qu’aucun n’a été observé dans le lot de souris shcontrôle.
Analyse de la folliculogenèse
L’hormone anti-Müllerienne, ou AMH, est sécrétée par les cellules de la granulosa des follicules en croissance et décroit lors du développement folliculaire terminal. L’évaluation du taux plasmatique de cette hormone permet donc d’estimer le pool de follicules primordiaux, primaires et secondaires présents dans les ovaires chez la souris (Kevenaar et al., 2006). Comme représenté dans la figure 3A, le taux d’AMH ne semble pas modifié chez les souris shRaptor par rapport aux souris shcontrôle. L’analyse des coupes sériées des ovaires a permis d’évaluer la population de follicules à antrum, et donc la folliculogenèse terminale, pour chaque souris (Fig. 3B). Chez les souris shRaptor, le nombre de gros follicules à antrum (avec un diamètre supérieur à 250µm) est plus important (p=0,005) que chez les souris shcontrôle. Le nombre de petits follicules à antrum (avec un diamètre entre 100 et 250µm) n’est lui pas significativement augmenté (p=0,065) chez les souris shRaptor.
L’augmentation du nombre de gros follicules à antrum, par rapport au souris shcontrôle, n’est visible que chez les souris shRaptor ne présentant pas de kyste ovarien (p=0,003) (Fig. 3C). La synthèse d’oestradiol est caractéristique de la folliculogenèse terminale (voir page 18 de l’introduction). Contrairement au comptage folliculaire, nous n’avons pas mis en évidence d’augmentation significative de la sécrétion d’oestradiol en diœstrus et en prœstrus (respectivement la sécrétion basale et la synthèse lors de la décharge ovulante) chez les souris shRaptor (Fig. 3D).
Fonctionnement hypothalamo-hypophysaire
Nous avons également analysé la sécrétion de la FSH, à l’origine du recrutement des follicules préantraux lors de la folliculogenèse terminale (voir page 18 de l’introduction). Comme le montre la figure 4A, le taux plasmatique de FSH est augmenté (p=0,054).
Le double marquage, d’une coupe frontale de cerveau de souris shcontrôle, des cellules infectées par le vecteur exprimant la GFP (en vert) et des fibres à GnRH (en rouge) est visible dans la figure 4B. Cependant, l’analyse du taux d’ARNm codant par la GnRH, dans la région hypothalamique, des souris shRaptor n’a pas montré de différence avec le taux observé chez les souris shcontrôle (Fig. 4C).
Métabolisme énergétique
Quinze jours après le début de l’observation (soit 18 jours après l’injection), les souris shRaptor présentent une augmentation de la prise de poids journalière équivalent à +21% de leur poids (vs +9% pour les souris shcontrôle) (Fig. 5A). Pourtant, aucune différence de la prise alimentaire journalière n’est observée (Fig. 5B). Toutefois, en cas de stress (après une nuit de jeûne), les souris shRaptor ont tendance à consommer plus d’aliment que les souris shcontrôle, bien que cette hausse ne soit pas significative (p=0,1) (Fig. 5C). Aucune différence n’est observée 24h après la remise en place de l’aliment.
Suite à l’injection intrapéritonéale de glucose (2g/kg), la glycémie et l’insulinémie sont suivies. Ce test de tolérance au glucose ne montre aucune différence entre les souris shRaptor et shcontrôle (Fig. 6A). Pour compléter cette étude du métabolisme énergétique, nous avons également analysé l’insulinémie plasmatique basale (lorsque les souris sont nourries ad libitum) ainsi que le taux de résistine et de triglycérides plasmatiques. Aucun de ces trois indicateurs n’est modifié chez les souris shRaptor (Fig. 6B 6C 6D).
• Conclusions et perspectives :
Au cours de notre travail, nous avons mis en évidence que l’expression de shRNA ciblant la protéine Raptor dans les cellules à l’interface du troisième ventricule et de l’hypothalamus induisait une augmentation de la folliculogenèse terminale ainsi que de la fréquence d’apparition de kystes ovariens. Ces résultats sont à rapprocher de plusieurs études chez la femme. En effet, chez les femmes traitées au sirolimus, une augmentation de la fréquence d’apparition de kystes ovariens (1 à 2 kystes par ovaire, apparition uni ou bilatérale) a été rapporté par plusieurs équipes (Cure et al., 2004 ; Alfadhli et al., 2009 ; Braun et al., 2012 (b)). Dans les deux premières études, 60 à 70% des femmes présentent au moins un kyste ovarien lorsqu’elles sont exposées à un traitement basé sur une association du sirolimus et du tacrolimus. Dans la dernière étude, l’exposition au sirolimus (seul) induit ces kystes à 57% des femmes de la cohorte.
Depuis, quelques équipes ont tenté de mimer ce traitement chez les rongeurs. Dans leur étude de 2011, Shivaswamy V. et coll. ne rapportent pas d’augmentation de l’incidence des kystes ovariens lors d’injections subcutanées (2mg/kg/jour) de sirolimus à des souris pendant 4 semaines (Shivaswamy V Transplant 2011). De même, l’exposition journalière au sirolimus de rattes n’induit pas de kystes ovariens après 3 semaines de gavage (3mg/kg/jour) (Braun et al., 2012 (b)). Cette absence de phénotype « kystique » pourrait s’expliquer par une durée d’exposition trop courte. Dans ces deux études, les auteurs ne montrent pas de modification de la folliculogenèse, ni de la sécrétion de la FSH. Cependant, comme nous l’avons développé dans la revue de synthèse (page 54), le complexe mTORC1 module la reproduction tant au niveau central et que dans l’ovaire. Dans les travaux cités ci-dessus, les méthodes de gavage et d’injections subcutanées permettent la diffusion de la molécule dans la circulation, agissant ainsi dans tout l’organisme. La divergence de ces phénotypes avec celui observé chez les souris shRaptor n’est donc pas surprenante. Notre démarche avait pour but de mieux définir les effets uniquement centraux d’un traitement au sirolimus et de ses conséquences ovariennes.
L’analyse du taux d’ARNm codant pour la protéine Raptor dans les régions hypothalamiques des souris shRaptor et shcontrôle ne met en évidence aucune modification (Fig.1E). Cette absence de baisse du signal pourrait être expliquée par la grande quantité de
matériel biologique analysée comparé au faible taux de cellules infectées. Pour pallier à cette non-confirmation de la baisse d’expression de Raptor, nous pourrions envisager de travailler avec une construction de shRNA-Raptor exprimant la GFP ou de reproduire ce travail sur des animaux plus gros (rattes, brebis), permettant d’isoler une partie de l’aire hypothalamique plus restreinte.
Bien que non identifiées ici, les cellules infectées par les vecteurs lentiviraux semblent être des tanycytes, cellules bordant le troisième ventricule. En effet, le marquage GFP sur des coupes frontales de cerveau de souris shcontrôle (Fig.1D) et le marquage tanycytaire présenté dans l’introduction (Fig.3 page 8) est très comparable. Ces cellules sont à l’origine de la dynamique de contact des axones des neurones à GnRH et des vaisseaux sanguins présents dans l’éminence médiane. La théorie actuelle voudrait que, durant la plus grande partie du cycle, la plupart des axones des neurones à GnRH est enchâssée dans les cellules tanycytaires. Au contraire, en fin de prœstrus, une part importante des axones a un accès direct aux capillaires grâce à la dynamique des cellules tanycytaires : elles se rétractent autorisant l’extension des axones et le développement d’invaginations du parenchyme capillaire vers les axones (pour revue : Prevot et al., 2010). De plus, lors de la phase pré-ovulatoire, les taux d’IGF-1 sont augmentés dans le noyau arqué. L’oestradiol circulant semble stimuler l’intégration de l’IGF-1 par les tanycytes, relais de cette information vers les neurones à GnRH. Ce message entraînerait une augmentation du nombre de récepteurs à l’oestradiol dans les neurones à GnRH permettant d’augmenter la sensibilité de ces cellules à la fin du prœstrus (pour revue : Fernandez-Galaz et al., 1997 et Cardona-Gomez et al., 2000). Notre hypothèse serait donc que, chez les souris shRaptor, l’inhibition de mTORC1 dans les tanycytes a pour conséquence une modification du relargage du GnRH dans l’éminence médiane. Mis en évidence dans la figure 4C, les cellules infectées semblent au contact des fibres des neurones à GnRH présents dans le noyau arqué et l’éminence médiane. Une étude en microscopie électronique dans les cerveaux des souris shRaptor en métaœstrus et en prœstrus permettrait de mieux d’observer si des modifications sont induites.
Chez ces souris shRaptor, la variation du message de la GnRH stimulerait la synthèse de FSH par l’hypophyse, augmentant ainsi le nombre de follicules antraux. En effet, la taille de la cohorte de follicules recrutés durant la folliculogenèse terminale est dépendante de la présence de FSH. L’accroissement de cette folliculogenèse est parallèle à la hausse du nombre de corps jaunes présents à la surface des ovaires (Fig. 7). Le nombre de follicules ovulés pourrait donc être augmenter entrainant un nombre de petits par portée plus important.
L’élévation de 15% que nous avons observé semble moins signicatif que l’amplification de la folliculogenèse, mais cette différence pourrait être le reflet de la capacité maximale de l’utérus. En effet, chez les souris shRaptor, les 15 petits par portée (14,7 en moyenne) sont significativement moins lourds que les 13 petits des souris shcontrôle (12,8 en moyenne) (annexe 1).
En parallèle de cette analyse du cycle œstrien, nous nous sommes également intéressés à certains marqueurs du métabolisme énergétique et les souris shRaptor ne présentent pas de variation majeure comparées aux souris shcontrôle. La légère modification du comportement alimentaire (à court terme) suite à un stress alimentaire (Fig. 5C) pourrait être rapprochée du comportement orexigène induit par une injection ICV de rapamycine à des rats (Cota et al., 2006, supplemental data).
Nous avons donc montré que l’expression du complexe mTORC1 dans les cellules, potentiellement tanycytaires, était importante pour la régulation de la folliculogenèse terminale par la FSH.
Les troubles de la fertilité de souris mâles invalidées pour la sous unité catalytique majoritairement exprimée dans le testicule et les dysfonctionnements structuraux et hormonaux observés dans le testicule fœtal murin exposé à un activateur pharmacologique de l’AMPK mettent en évidence l’implication de ce complexe dans la fonction de reproduction chez la souris mâle.
Jusque-là très peu étudié, nos travaux ont permis de relier l’AMPK à la fonction de stéroïdogenèse du testicule. Comme mis en évidence dans les cellules stéroïdogènes chez la femelle, nous avons constaté que la présence d’un activateur de l’AMPK inhibe la synthèse de stéroïdes et que l’inactivation de l’AMPK stimule la testostéronémie testiculaire. Nos résultats sont corroborés par ceux obtenus récemment sur la lignée MA-10 (issue de cellules de Leydig tumorales murines). Dans cette étude, les auteurs observent qu’une stimulation de l’activation de l’AMPK entraîne une diminution de la transcription des gènes des enzymes de la
stéroïdogenèse (3βHSD et P450scc) ainsi que du transporteur StAR (Ahn et al., 2012). Nous
avons également mis en évidence cette baisse des protéines impliquées dans la stéroïdogenèse
(Cyp 11a1 Cyp17a1 3βHSD et StAR) dans le travail in vitro de l’article2 (la figure 12 de
l’introduction rappelle les enzymes associées à la stéroïdogenèse).
En conclusion de ce récent travail, les auteurs proposent la voie de signalisation suivante (Fig. 35):
Dans la cellule de Leydig, la liaison de la LH à son récepteur active l’adénylate cyclase et stimule donc la production d’AMPc. La stimulation de la PKA induit l’activation du facteur de transcription CREB et la transcription de PEPCK. La PEP
carboxykinase, ou PEPCK, augmente l’ATP cellulaire et donc inhibe l’AMPK, levant le frein que ce complexe exerce sur le récepteur nucléaire LRH-1. LRH-1 stimule la transcription des protéines impliquées dans la stéroïdogenèse StAR, p450scc et
3βHSD induisant la synthèse de testostérone par ces cellules.
Figure 35 : modèle proposé de la voie de signalisation de la régulation de la stimulation stéroïdogène de la LH dans les cellules de Leydig murines.
D’après Ahn et al., 2012. (DAX-1: dosage-sensitive sex reversal-adrenal hypoplasia congenital critical region on the X chromosome gene1 ; CRTC2: CREB regulates transcription coactivator 2 ; CREB: cAMP-responsive element binding transcription factor ; PEPCK: phosphoenolpyruvate carboxykinase; G6Pase: glucose-6-phosphatase; LRH-1 liver receptor homolog-1).
Dans l’article 1, nous avions émis l’hypothèse que l’hypertestostéronémie observée chez les mâles
α1AMPK-/- était due à une hyperactivation de la voie
de signalisation du récepteur à la LH dans les cellules de Leydig. Cette hypothèse semble plausible en comparant nos observations au modèle proposé par le Dr. Seung won Ahn (Fig. 36). En effet, nous
supposons que l’absence de l’α1AMPK induit un
rétrocontrôle positif au-dessus de la production d’AMPc puisque l’AMPc est augmenté ainsi que la phosphorylation de CREB.
Figure 36 : modèle du dérèglement de la voie de signalisation du récepteur à la LH dans les cellules de Leydig des souris a1AMPK-/-.
Adapté de Ahn et al., 2012
L’hyperactivation de cette voie pourrait être soit 1) le reflet d’une augmentation du nombre de récepteurs à la surface des cellules de Leydig soit 2) une modification de l’activité de ces récepteurs.
1) Pour étudier cette proposition, il serait intéressant d’analyser l’expression du gène du
récepteur à la LH (LH-R) par RT-PCR quantitative chez les souris mâles α
1AMPK-/-. En effet, dans l’article 2, nous avons mis en évidence une baisse de la transcription du gène du LH-R en présence d’un activateur de l’AMPK dans les cultures organotypiques de testicules fœtaux murins. Nous pourrions également
envisager, à partir de cultures primaires de cellules de Leydig de souris α1AMPK-/-,
de quantifier le nombre de LH-R après une exposition à la LH marquée.
2) Une modification de l’activité des récepteurs pourrait être le reflet d’une inhibition des
phosphodiestérases (PDE) et donc d’une augmentation de l’AMPc disponible dans les cellules de Leydig. Pour tester cette hypothèse, nous pourrions doser l’AMPc produit par une population de cellules de Leydig purifiées par la technique du FRET (Transfert d’énergie entre molécules fluorescentes ou Förster resonance energy transfer).
Chez l’homme, les mutations activatrices du récepteur à la LH induisent une hyperplasie Leydigienne et une augmentation de la testostérone comme observées chez les souris mâles
α1AMPK-/- (Latronico et al., 2000 et pour revue : Huhtaniemi et al., 2005). Cette
hyperactivation est également corrélée à une puberté précoce et à une augmentation de l’incidence des adénomes à cellules de Leydig. Ces deux phénomènes n’ont pas été évalués
dans les souris α1AMPK-/-.
Plusieurs études complémentaires citées ci-dessus permettraient de confirmer notre hypothèse et de compléter les études sur la régulation de l’AMPK par les récepteurs couplés aux protéines G (pour revue Hutchinson et al., 2008).
Plusieurs observations suggèrent que les anomalies de structure identifiées chez les
spermatozoïdes α1AMPK-/- seraient dues à des dysfonctionnements du complexe jonctionnel
existant entre les cellules de Sertoli et les cellules germinales. En effet, dans le testicule, l’existence de jonctions particulières dans la partie apicale du tube séminifère, de type spécialisation ectoplasmique (ou jonction SE), permet la mise en place d’un réseau dense de filaments d’actine autour des spermatides (pour revue : Wong et al., 2008 ; Kopera et al., 2010 ; Cheng et al., 2011). Cette jonction aux propriétés hybrides (elle comprend des protéines de jonctions serrées, de jonctions communicantes et de contacts focaux) et le réseau dense de filaments permettent l’orientation et le modelage des spermatides.
Afin de vérifier si le défaut de l’α1AMPK dans les cellules de Sertoli induisait les
malformations de spermatozoïdes observés, nous avons généré une nouvelle lignée de souris
spécifiquement invalidées pour l’α1AMPK dans les cellules de Sertoli.