b. Marquages cytochimiques :

Coloration GUS :

Le gène GUS code pour la β-glucoronidase dont le substrat (X-gluc) est contenu dans le tampon de coloration. La dégradation du X-Gluc par la β-glucoronidase entraîne la formation d’un précipité bleu. Il y aura donc apparition d’une coloration bleue au niveau de la zone d’expression du promoteur lié au gène rapporteur.

La coloration GUS est effectuée sur des grains de pollen secs, des tubes polliniques cultivés in-vitro et in-vivo sur des fleurs auto-pollinisées. Les fleurs et les grains de pollen secs sont fixés dans une solution d'acétone 80 % sur de la glace pendant 20 min, puis l'acétone est retiré à la pipette pour les fleurs et après centrifugation 7 min à 5000 g pour les grains de pollen. Les tubes polliniques n’ont pas été traités à l’acétone mais centrifugés 7 min à 5000 g afin d’enlever le milieu de germination.

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Les échantillons sont ensuite rincés 3 fois avec du tampon (50 mM de Tampon Phosphate de Sodium ph 7 ; 2 mM de ferricyanide de potassium et 0,2 % de Triton X100). Les échantillons sont incubés dans le tampon de coloration (composé de tampon de rinçage supplémenté de X-Gluc à 1 mM final) à 37 °C, à l’obscurité dans une étuve jusqu'à l’apparition de la coloration (environ 16 h). Les fleurs sont décolorées par des bains successifs d’éthanol 70% et observées sous loupe binoculaire. Les grains de pollen et les tubes polliniques n’ont pas été décolorés mais directement observés au microscope en lumière transmise.

Coloration à l'aniline bleue des tubes polliniques in-vivo :

Les pistils pollinisés et fixés (cf. Culture du pollen in-vivo) sont réhydratés dans des bains successifs de 10 min dans des solutions d’éthanol à 70, 50, 30% (v/v) puis un bain d’eau milliRO. La décoloration des tissus est réalisée en immergeant les pistils dans une solution de NaOH (8 M) sur la nuit. Le pistil est lavé 5 fois durant 10 min avec de l’eau milliRO afin d’éliminer la soude. Une incubation de 2 h à l'obscurité dans une solution de 0,1 % (p/v) de bleu d’aniline décolorée dans un tampon 100 mM K₃PO₄ à pH 11-12 a permis la détection de la callose et ainsi la visualisation des tubes polliniques dans le pistil en microscopie à fluorescence.

Test de viabilité au FDA (Fluorescein Di Acetate) :

Le principe de la coloration vitale au FDA est le suivant : lorsqu'une cellule vivante est en contact avec FDA qui est non fluorescent, les estérases de cette cellule vont cliver la molécule et la rendre fluorescente (Figure 35). Par conséquent, seules les cellules vivantes fluoresceront.

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Figure 35 : Schéma représentant l'action des estérases d'une cellule vivante avec le FDA, permettant ainsi l’estimation de la viabilité.

Les estérases sont représentées par les secteurs orange (d'après Daher et al., 2009).

Ainsi par comptage des grains de pollen en lumière transmise comparé au comptage des grains de pollen fluorescents au microscope à épi-fluorescence, on peut déterminer le pourcentage de grains de pollen viables.

La solution mère de FDA (Sigma) à 10 % (p/v dans de l'acétone) est diluée dans une solution de saccharose 10% pour une concentration finale de 0,2 mg.mL-1. Des grains de pollen matures et réhydratés durant 30 min dans du MGL sont centrifugés 10 min à 4000 g avant d’être repris dans 250 µL de cette solution FDA/saccharose. Le mélange est déposé sur lame et laissé à l'obscurité pendant 5 min avant observation au microscope à épi-fluorescence.

II. 4. c. Immunomarquages :

Immunomarquage de surface :

Des grains de pollen secs, imbibés et des tubes polliniques issus de 80 fleurs et cultivés pendant 6 h sont fixés pendant 2 h dans du tampon (v/v) composé de 100 mM de tampon PIPES, pH 6,9 ; 4 mM MgSO₄ 7H₂O ; 4 mM EGTA ; 10 % (p/v) de saccharose et 5 % (v/v) de formaldéhyde, puis déposés sur des lames à puits préalablement traitées avec 0,01 % (v/v) de Poly-L-Lysine.

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Les lames sont rincées 3 fois avec une solution tampon Phosphate salin 1X (Phosphate Buffer Saline, PBS : 50 mM de tampon PIPES pH 6.9, 2 mM MgSO4 7H2O, 2 mM EGTA). Les sites non spécifiques sont saturés par 30 µL d’une solution de PBS-lait 3 % (p/v) pendant 30 min à température ambiante. Après 3 rinçages avec du PBS, les anticorps primaires (JIM5 et JIM7 ou LM19 et LM20) (Tableau 12) dilués au 1/5ème sont ajoutés et incubés avec les grains de pollen ou les tubes polliniques pendant 16 h à 4 °C.

Tableau 12 : Liste des anticorps monoclonaux dirigés contre les épitopes associés aux HGs.

Anticorps primaire

Organisme de

production ^{Polymère reconnu Références}

JIM 5 Rat HG faiblement méthyl-estérifiés Clausen et al., 2003

JIM 7 Rat HG fortement méthyl-estérifiés Clausen et al., 2003

LM 19 Rat HG faiblement méthyl-estérifiés Verhertbruggen et al., 2009

LM 20 Rat HG fortement méthyl-estérifiés Verhertbruggen et al., 2009

Les grains de pollen et les tubes polliniques sont rincés 3 fois avec du PBS puis incubés à 30 °C pendant 3 h à l’obscurité avec l’anticorps secondaire anti-rat couplé à la Fluorescéine IsoThioCyanate (FITC), dilué au 1/100ème dans du PBS. Les échantillons sont finalement rincés 3 fois avec du PBS, avant d’être observés sous microscope à épi-fluorescence. Les contrôles négatifs sont aussi réalisés en omettant l’anticorps primaire.

Immunomarquage sur coupes semi-fines :

Les lames sont rincées 3 fois avec une solution de PBS. L'étape de saturation et les étapes suivantes d'immunomarquages sont identiques à celles effectuées pour les immunomarquages de surface (cf. ci-dessus).

II. 4. d. Microscopes, acquisition et traitement d’images :

Une partie des photographies prises en microscopie ont été réalisées à l'aide du matériel disponible sur la plate-forme PRIMACEN ou le plateau technique du GRR Végétal, Agronomie, Sols et Innovations, tous deux financés par la région Haute-Normandie et situés sur le campus de l'Université de Rouen.

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Les lames de culture de pollen in-vitro et in-vivo sont observées en microscopie photonique et à épi-fluorescence (Leica DLMB), et les photographies ont été acquises à l’aide du programme Leica FW4000 et de la caméra Leica DFC300FX.

Pour les colorations à l’aniline bleue, les pistils ont été observés sous UV avec un filtre permettant une excitation entre 320-390 nm et une émission à 461 nm. Pour la coloration vitale au FDA, des grains de pollen ont été observés avec l'excitation sous UV (excitation à 470 nm, émission à 515-565 nm). Finalement pour les marquages FITC, les échantillons ont été observés avec un filtre permettant une excitation entre 485–520 nm et une émission entre 520–560 nm.

Pour le time laps, les lames sont placées sur le microscope inversé (Leica DMI 6000B équipé d'une caméra Leica DFC450C et du logiciel LAS) et les images ont été acquises au rythme d’une image toutes les 5 min pendant 6 ou 24 h.

Les observations de la YFP ont été réalisées avec le microscope confocal inversé (Leica TCS SP2 AOBS) équipé du logiciel LAS AS avec un filtre d'excitation à l'Argon, 488 nm ; un filtre d'émission SPC 525 d'une longueur d'onde comprise entre 510 et 530 nm. La puissance du laser, le gain et l'offset sont identiques à chaque prise afin de pouvoir comparer les images entre-elles. Un contrôle approprié a été réalisé sur des grains de pollen de type sauvage pour exclure la possibilité de diaphonie entre l'auto-fluorescence du grain de pollen et le fluorochrome avant l'acquisition de l'image.

Les grains de pollen secs ont aussi été observés en microscopie électronique à balayage (Hitachi TM3000) en mode analytique (15 kV) sans préparation préalable.

L’ensemble des mesures (le pourcentage de germination du pollen, longueur et vitesse de croissance des tubes polliniques …) a été réalisé sur les images à l'aide du logiciel ImageJ (Abramoff et al., 2004). Le plugin d'ImageJ permettant le comptage de cellules : Cell counter, a été utilisé. Un grain de pollen a été considéré comme germé lorsque la longueur du tube est au moins égale au diamètre du grain.

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