Para garantir que o método proposto disponha de informações confiáveis, o método deve conter avaliações que o validem. Segundo Lanças (2004), a validação deve garantir, através de estudos experimentais, que o método atenda as exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados.
Apesar de ainda não existirem sistemas de validação que assegurem a confiabilidade dos procedimentos analíticos que vêm sendo empregados na determinação de micropoluentes emergentes em matrizes ambientais como esgotos e águas superficiais, procuraram-se seguir os critérios e recomendações de alguns órgãos nacionais de avaliação da qualidade de laboratórios de análise, como o Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial - INMETRO e a Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA.
Como parâmetros analíticos normalmente utilizados para a validação de métodos de separação, foram utilizados: seletividade, linearidade, precisão, exatidão, limite de detecção e limite de quantificação.
Seletividade
A matriz da amostra pode conter componentes que interferem no desempenho da medição pelo detector selecionado, sem causar um sinal visível no teste de especificidade. Os interferentes podem aumentar ou reduzir o sinal, e a magnitude do efeito também pode depender da sua concentração (INMETRO, 2010). A seletividade avalia o grau de interferência de espécies como outra substância ativa, excipientes, impurezas e produtos de degradação, bem como outros compostos de propriedades similares que possam estar, porventura, presentes (ARAÚJO, 2006). A seletividade foi obtida pela avaliação do espectrômetro de massas que comparou o espectro do pico obtido na separação com o de um padrão, indicando a presença do composto puro.
Linearidade e sensibilidade
A linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração da substância em exame, dentro de uma determinada faixa de aplicação. O intervalo de trabalho expressa a faixa entre a menor e a maior concentração dos padrões usados na construção do gráfico de calibração (BRITO et al., 2001). Nesse trabalho, a linearidade foi obtida por padronização externa, e de acordo com a resolução do INMETRO, um valor de coeficiente de correlação (r) maior que 0,90 é aceitável. A ANVISA recomenda um coeficiente de correlação igual a 0,99 e o INMETRO um valor acima de 0,90 (INMETRO, 2010; ANVISA, 2011).
As curvas analíticas foram preparadas pelo método do padrão externo, com injeções em duplicatas. Tal método compara a área da substância a ser quantificada na amostra com as áreas obtidas com soluções de concentrações conhecidas preparadas a partir de um padrão. Utilizando um gráfico ou a equação da curva resultante, pode-se calcular a concentração desta substância na amostra a partir da área da substância obtida no cromatograma resultante de uma injeção separada (RIBANI;BOTTOLI et al., 2004). Experimentalmente foram preparadas soluções estoque em metanol para os micropoluentes selecionados. A partir das soluções estoques, prepararam-se uma solução trabalho multielementar de concentração 1000 mg/L em metanol. A partir dessa solução, foram preparadas soluções padrões variando de 0,1 a 100 mg/L, as quais foram armazenadas em frascos de vidro a 10ºC.
A sensibilidade foi expressa pelo coeficiente de inclinação da curva de calibração e avaliando simultaneamente o intervalo onde ocorre uma variação linear entre a concentração do analito e a área obtida.
Precisão
A precisão representa a dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões sob condições definidas (ARAÚJO, 2006). O coeficiente de variação (CV%) pode ser mais útil neste caso, pois foi normalizado com base na concentração e deste modo ele é praticamente constante ao longo da faixa de interesse, contanto
que esta não seja muito grande (INMETRO 2007). O Coeficiente de Variação é calculado de acordo com a equação 4.1:
(4.1) Onde: DP = desvio padrão; CMD = concentração média determinada A precisão foi avaliada em termos de repetibilidade através do cálculo da estimativa do DP e do CV para um número de cinco repetições, onde de acordo com o INMETRO são aceitos CVs de até 20 %.
Limite de detecção (LD)
O limite de detecção representa a menor quantidade do composto de interesse que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada como um valor exato. Já o limite de quantificação corresponde à menor quantidade do composto de interesse que pode ser quantificada com exatidão, utilizando-se um determinado procedimento experimental (LANÇAS, 2004b).
Ambos os limites podem ser determinados de três maneiras diferentes: empregando-se o método visual, o método da relação sinal ruído e o método baseado nos parâmetros da curva analítica. No método sinal-ruído, o sinal de amostras contendo o analito em concentrações muito baixas é comparado com o sinal de uma amostra “branco” (matriz isenta do analito de interesse), estabelecendo uma relação sinal-ruído que pode ser 3:1 ou 2:1, proporções geralmente aceitas como estimativa do limite de detecção.
Limite de quantificação (LQ)
O limite de quantificação é definido como a menor concentração do analito que pode ser quantificada na amostra, com exatidão e precisão aceitável, sob as condições experimentais adotadas. Segundo Ribane et al., (2004), o LQ também pode ser estabelecido pelos mesmos métodos utilizados para LD (método visual, método sinal-ruído e método baseado em parâmetros da curva analítica), sendo que para LQ a relação sinal-ruído adotada é 10:1 e a equação 4.2 utilizada baseada em parâmetros da curva analítica é a seguinte:
(4.2) Onde: s é a estimativa do desvio padrão da resposta e S é a inclinação ou coeficiente angular do gráfico de calibração.
Recuperação da extração em fase sólida
O ensaio de recuperação constitui o método mais utilizado para validação de processos analíticos. A recuperação está relacionada com a exatidão, pois reflete a quantidade de determinado analito, recuperado no processo, em relação à quantidade real presente na amostra (BRITOet al., 2001).
Foram realizados cálculos de recuperação do composto no cartucho C18 utilizado nas amostras sintéticas, água milli-Q e amostra real dopadas com os micropoluentes. A porcentagem de recuperação (R) foi calculada utilizando a equação 4.3:
á (4.3)
4.4 Avaliação da Capacidade de Remoção dos Micropoluentes Emergentes