Atténuation des diérentes sour es de bruits grâ e à la déte tion

te tion syn hrone multiplexée

Grâ e à la déte tion syn hrone multiplexée, les diérentes sour es de bruit pré- sentéesdansleparagraphepré édent sontatténuéessansmodier lavaleurdu signal equi permet d'améliorer leRSBdemanière signi ative.

Lesdiérentes amérasquenousavonsutiliséesétaientrefroidies(

−15

◦

)detellesorte quelebruit d'obs uritéestnégligeable devant les autressour es debruit.

Parailleurs,dansnosexpérien es,nousmoyennonsungrandnombred'images

N

pour obtenir lesquatreimages né essairesà ladémodulation. Enraison de e moyennage, lesbruits dele ture etde numérisation dé roissent ommel'inverse de

√

N

. Lorsdu pro essus de démodulation (Eq.II.51) où l'on soustraie les images moyennées deux à deux, es bruits sont a rus par un fa teur multipli atif en

√

2

. Ainsi dans nos appli ationsoù

N

estgrand, esdeux bruitssont négligeables.

Ainsi,lorsqu'onutiliseune amérarefroidieetqu'onmoyennesurungrandnombrede périodeslesquatreimagesné essairesaupro édédedéte tionsyn hronemultiplexée, lesbruitsd'obs urité etde le turesontnégligeables etl'expressiondu RSBdevient :

RSB =

(Bi2.P ηeT )

2

(Bi2.P + Bi1)ηeT

(II.55)

Comme le bruit de photons est dé orrélé d'une a quisition à l'autre, il augmente omme

√

Nim

, où

Nim

est le nombre d'images a umulées, alors que le signal aug- mentelinéairementave

Nim

.Ainsi,l'utilisationde

Nim

imagesa umuléespermetde multiplierleRSBparunfa teur

√

Nim

pour ha unedesquatreimagesa quises.Lors delasoustra tion desimagesdeux àdeux (Eq.II.51), le gainenRSBest onservé.

Nousremarquonsdansl'Eq.II.55quelesseulessour esdebruitempê hantd'atteindre lavaleuroptimumduRSB, oùledispositifexpérimentaln'est limitéquepar lebruit de photons, est le bruit instrumental orrespondant au u tuations de la sour e lu- mineuse etauuxde photonparasites.

Pourallerjusqu'auboutdel'étudedel'eetdeladéte tionsyn hronemultiplexéesur leRSB,nouspouvonsdé omposerlesbruitsinstrumentaux endeux omposantes. La lumière provenant de la sour e a une omposante ontinue ne orrespondant pas au bruit

Bi2 0= 1

etune omposante ontenanttoutleresteduspe tre,

B

i2 ¯0

quiparasite lesignalà déte ter.En equi on erneles lumièresparasites,on peut dé omposerle bruitendeux omposantes:l'uneàlafréquen edemodulation

f0

,

Bi1 f

0

,etl'autreà toutes les autres fréquen es

¯

f0

,

B

i1 ¯f0

.Ainsi, les deuxtypesde bruits instrumentaux s'expriment :

Bi1

=

Bi1 f0

+ Bi1 ¯f0

Bi2

=

Bi2 0+ Bi2 ¯0

(II.56)

Sa hant que le ux de photon

P

est modulé à

f0

, après l'a quisition des images et la moyenne des é hantillons homologues, le al ul de la omposante de la TFD par soustra tion d'images permet de ne onserver que la omposante à

f0

du ux de photon total. En supprimant toutes les omposantes fréquentielles

¯

f0

du signal déte té,ladéte tionsyn hronemultiplexéepermetdon d'avoirunRSBenpuissan e optimisé:

RSB =

((Bi2 0+ Bi2 ¯0)P ηeT )

2

((Bi2 0+ Bi2 ¯0)P + (Bi1 f0

+ Bi1 ¯f0))ηeT

≡

(Bi2 0P ηeT )

2

(Bi2 0P + Bi1 f0)ηeT

(II.57)

Seule persiste alors la omposante

Bi1 f

0

qui nous empê he d'atteindre la valeur limitedu RSB.Comme nousl'avons expliquéendé omposant leuxde photonspa- rasite, lavaleur de ha une des omposantes dépend grandement de la onguration de l'instrument ainsiquede la"propreté" de l'é hantillon. C'estpourquoi, lors dela on eption des instruments, nous avons her hé à e que ette omposante soit mi- nimale etque nousavonsmis au point une te hnique de fabri ation des é hantillons garantissant au maximum l'absen e d'éléments diusants autres que les nanoparti- ules dansl'é hantillon(voirAnnexe 1).

Dans ette se tion nous avons vu que la déte tion syn hrone multiplexée, par l'a umulation etla soustra tion d'images, permet de rendre négligeable le bruit de le ture(bruitte hnique)etdeminimisertoutesles omposantesparasites ontinuesde lalumière déte tée. Par ailleurs, l'a umulation d'ungrand nombred'images permet de diminuer l'importan e relative du bruit de photons (bruit intrinsèque) dans le RSB. Ainsi, nous parvenons à obtenir un RSB théorique optimisé qui sera rendu maximumenminimisantexpérimentalement lesuxdelumière parasitemodulés lors de la on eptionde l'instrument etdesé hantillons.

Imagerie et Spe tros opie de

nanoparti ules d'or ave

modulation spatiale de

l'é hantillon

Sommaire

III.1 Imagerieplein hampdenanoparti ulesd'or. . . 62 III.1.1 Imagerieenilluminationin ohérente . . . 63 III.1.2 Imagerieenillumination ohérentelaser . . . 76 III.1.3 Con lusionsurl'imagerie . . . 82 III.2 Spe tros opiedenanoparti ulesindividuelles . . . 84 III.2.1 Dispositifexpérimental . . . 84 III.2.2 Spe tresexpérimentauxet omparaisonave lesse tionsef-

 a essimulées . . . 85 III.2.3 Con lusionsurlaspe tros opie . . . 89 III.3 Con lusion . . . 89

Cesdernières annéesplusieurs te hniquesoptiques ont étédéveloppéespourima- geretétudierspe tralement desnanoparti ulesmétalliquesindividuelle. Danslame- sure où les nanoparti ules de métaux nobles sont ouramment utilisée dans ertains domaines de la biologie en raison de leur bio ompatibilité, le hoix d'une déte tion et d'une ara térisation optique est justiée ar les onditions environnementale en

mi ros opieoptiquepermettent l'étuded'organismevivants ontrairement àd'autres te hniquesde meilleurerésolution ommelami ros opie éle tronique.

L'intérêt des nanoparti ules d'or pour les appli ations biologiques tient au fait que leur signal optique est plus important que elui de petite molé ules. Ainsi, en fon - tionnalisant les parti ules ave es petites molé ules il est possible de déte ter leur présen eetmêmedesuivreleursdépla ementsdansle asdel'imagerieentempsréel. L'étudedespropriétés spe tralesdesnanoparti ulestrouvedesappli ationsen biolo- gieàl'é helle desréa tions himiques. Eneet, omme nousl'avonsvuau Chap.I,le spe tred'unenanoparti ule dépendfortement de sonmilieu environnant.Ainsi, lors- qu'une molé ule xée à une nanoparti ule réagit ave une autre molé ule, le milieu environnant dela parti uleest modié etsonspe tre n'est plusle même qu'avant la réa tion.

Même si la déte tion de nanoparti ules métalliques individuelles est plus aisée que elle de petites molé ules, le signal à déte ter reste très faible e qui onstitue la di ulté majeure pour l'imagerie etlaspe tros opie de tels objets.En eet, omme nous l'avons montré au Chap.I, la puissan e du signal à déte ter est dire tement proportionnelleà la se tione a e de diusion qui varie entre

10

−20

et

10

−16_m2

(à

λ = 532 nm

) pour des parti ules de diamètre ompris entre 10 et

50 nm

ontenues dansduverre.

Pour situerle ontextedenosexpérien es d'imagerieet despe tros opiedenano- parti ulesmétalliques individuelles,nous présentons deux instruments représentatifs des appro hes envisagées dans e domaine. Les paramètres ara téristiques de es instruments seront présentés en on lusion et omparés à euxde notre dispositif. En 2005, une équipe de l'université Duke (Caroline du nord) [23℄ a présenté un ins- trument utilisant un mi ros ope inversé permettant une illumination in ohérente en fond ultra-noir à l'aide d'un ondenseur de grande ouverture numérique et d'un ob- je tifà immersionà huile. Lalumière àlasortie dumi ros ope peut être dirigéesoit versune améraCCDpourl'imagerie desnano-objets,soitversunspe tromètreima- geurdira tant qui en dira te une partie, séle tionnée spatialement par une fente, sur une deuxième améra CCD. Ce dispositif permet ainsi de faire la spe tros opie de plusieurs parti ules individuelle simultanément en parallèle d'une imagerie plein hamp, .à.d. ne né essitant pas de balayage de l'é hantillon. Néanmoins, omme le signaldiuséesttrèsfaibleetdé roît ommelediamètredelaparti uleàlapuissan e six, et instrument, omposé d'éléments performants, ne permet pas de déte ter et d'étudierspe tralement des objetsde diamètreinférieur à

70 nm

.

En2008,àl'universitédeLyon1[31℄,unautreinstrumentaétédéveloppépermettant d'imageretde ara tériser lespe tre de nanoparti ulesmétalliques. Ce dispositifest une adaptation en lumière blan he de la méthode de spe tros opie par modulation spatiale (SMS)[34℄ développée à l'université deBordeaux 1.Cette te hnique est ba- sée sur la modulation spatiale par translation piézoéle trique de l'é hantillon pla é dansleplanfo ald'unfais eaudelumière blan hetrèsfo alisé.Pour desé hantillons dilués, typiquement moins d'une parti ule par

µm

2

située dans la ta he fo ale. Dans e as, en raison de la modulation de position, la parti ule setrouve alternativement dansethors dupoint fo al.Le fais eaulasertrès fo aliséestainsio ulté alternativementpar laparti ule,produisant unemodulation de l'énergie transmise olle tée par un obje tif de mi ros ope. L'amplitude de ette modulation est dire tement proportionnelle à la se tion e a e d'extin tion et est don trèsfaible.Unefoislefaiblesignald'extin tiondelaparti ulemoduléetdéte té parunphotomultipli ateur,ilestpossibledeledistinguerdufais eautransmisàl'aide d'une déte tion syn hrone. Il est ainsi possible d'imager des nano-parti ules indivi- duelles par balayage de l'é hantillon. Pour la spe tros opie, le photomultipli ateur est rempla é par un spe trophotomètre déterminant quantitativement la puissan e diusée à haque longueur d'onde. Ce dispositifutilisant une déte tion syn hroneet une modulation spatialede l'é hantillon estplus sensible quele pré édent et permet de déte teretde ara tériserspe tralement desparti ulesde

40 nm

dediamètre.Ce- pendant, il présente l'in onvénient de né essiter un balayage de l'é hantillon e qui a roîtfortement letemps d'a quisitionetajoutedubruità lamesureparlebiaisde la onversiondu bruit temporel dela sour een bruit spatialdansl'image.

Il est intéressant de noter que les te hniques les plus performantes en terme de sensibilitésont elles baséessurunemodulation dufaiblesignaldediusionou d'ab- sorption (spatiale ou photothermique [39℄) asso iée à un dispositifde déte tion syn- hronepermettant d'extraire e signaldu fortfond ontinu.Ainsi, outreledispositif de modulation spatiale que nousavons présenté [31℄, d'autreste hniques sont issues de la méthode SMS utilisant la ombinaison modulation/déte tion syn hrone. Par exemple,danslesréféren es [28,92℄sontprésentésdesdispositifstrès similairesoùla lampeblan he [31℄estrempla éepar unesour edelongueur d'ondeajustable[28,92℄ permettant d'augmenter lapuissan e lumineuse in idente etdon lesignal mais qui présententl'in onvénient de né essiterun balayage enlongueur d'ondequiinduitdes in onvénients similaires à eux du balayage spatial en terme de bruit et de temps d'a quisition .Toujours en lien ave la méthode SMS, d'autreste hniques de modu- lationspatialeplusséle tivesenverslesnano-objets, ommeledépla ementalternatif de parti ules par l'appli ation d'un hampmagnétique alternatif [93℄ ont vule jour. Néanmoins ettete hnique né essitel'utilisationde parti ulesmagnétiques,générale- ment nonbio- ompatible, etnepourradon pasêtreappliquée auxmêmesdomaines que la déte tion de nanoparti ules d'or qui est prin ipalement axée sur des appli a- tions biomédi ales.

Ayant présenté es deux instruments prin ipaux [23,31℄, nous proposons de dé- velopper une te hnique permettant une déte tion des nano-objets en plein hamp (typiquement

100 × 100 µm

2

)ave un apteurmatri ielpourminimiserletemps d'a - quisitionetéviter lesbruitsinduitspar unbalayage del'é hantillon[94℄.Nousavons montré quela ombinaison d'unemodulation dusignaletd'une déte tionsyn hrone estoptimaleentermedesensibilité.Ainsi,pourobserverdesobjetsdepetitesdimen- sionsnousmodulons laposition del'é hantillonet nousdéte tons lesignal,non plus ave unesimpledéte tionsyn hronemaissuivantunpro essusdedéte tionsyn hrone multiplexée(voirSe .II.2) ompatible ave l'imagerie plein hamp.Pourl'étudespe -

tros opique,nousutilisonsunspe tromètreimageur ommedanslaréféren e[23℄an d'enregistrersimultanémentlespe tredeplusieursparti ulesindividuellesenparallèle del'imagerie.

Dansune première partie, nous exposons un dispositif d'imagerie plein hampbasés surunemodulationspatiale oupléàunpro essusdedéte tionsyn hronemultiplexée (voir Se .II.2). Ce dispositif utilise une illumination fond noir ou guidée suivant les propriétés optiques du substrat de l'é hantillon étudié. Dans une deuxième partie, nousadaptons le dispositif d'imagerie de façon à pouvoir mesurerle spe tre de par- ti ulesindividuelles en parallèle de l'imagerie.

III.1 Imagerie plein hamp de nanoparti ules d'or

La puissan e des signauxà déte ter est égale au produit de lase tion e a e et de lapuissan e surfa ique in idente. Comme nous l'avons vuau Chap.I, les se tions e a es de diusion de sphères de diamètre variant de 10 à

50 nm

sont omprise entre

10

−20

et

10

−16_m2

. Cela induit que la puissan e de signal à déte ter est très faible (

10

−10

à

10

−6_W.m−2

) même pour une forte puissan e surfa ique in idente (

10

10_W.m−2

).

Par onséquent, le dispositif que nous avons développé est optimisé de manière à minimiserle bruitetlessignauxparasites qui empê he dedéte terlefaible signalde diusiondes nano-objets.Ainsi, e dispositifprésenteune illumination de type fond noir, diérente suivant les propriétés optiques dusubstrat desé hantillons à imager, permettant de ne déte ter que la lumière diusée par les nano-objets, la majeure partie delapuissan e lumineuse in identene parvenant pasjusqu'audéte teur. Pour minimiser les bruitsde déte tionetles signauxoptiques parasites, nouspropo- sonsdemodulerlesignaldéte téviaunemodulation delapositiondel'é hantillonet deledéte tersuivantunpro essusdedéte tionsyn hronemultiplexée(voirSe .II.2). Commepremièreexpérien e,nousproposonsd'imageruné hantillondéterministe é lairéave uneilluminationKöhlerenlumièrein ohérente oupléeundispositiffond noir(Se .II.1)dansun mi ros ope ommer ial.

Unefoisassuréparlanaturedéterministedel'é hantillonque edispositifexpérimen- tal permet de déte ter des nano-objets, nous souhaitons imager des nano-objets de dimensions inférieures présentant une répartition aléatoire dans l'é hantillon. Ainsi, il estné essaire d'a roître la puissan e surfa ique in idente sur les parti ules. Pour e faire, nous réalisons des é hantillons à substrat transparent permettant une illu- mination en réexion totale interne qui engendre beau oup moins de pertes sur le uxin ident qu'un dispositiffond noir ommer ial.Ave e hangement de dispositif d'illumination, lapuissan e du signaldiusé est a rue en raison de l'a roissement delapuissan e surfa ique in idente.

Enn, omme nous l'allons voir par la suite, pour les petites parti ules, l'imagerie ohérenteestplussensiblequel'imageriein ohérente.Ainsinousremplaçonslasour e

in ohérente par une sour e laser en onservant une illumination en réexion totale interne quiest optimumen termedepuissan e surfa ique in idente.

Dans le document Imagerie et spectroscopie de nanoparticules d'or en microscopie optique plein champ (Page 71-78)