Approche expérimentale (in vivo)

Dans cette partie du travail, nous avons réalisé des expérimentations de contamination des bivalves (Ruditapes philippinarum et Crassostrea gigas) à un modèle de HAP, le benzo(a)pyrène (BaP), au laboratoire afin d’évaluer les effets biochimiques et génétiques de ce composé, ainsi que sa génotoxicité chez ces bivalves. Les palourdes japonaises ont été contaminées par le BaP en utilisant différents voies de contamination (voie directe et voie trophique), différents concentrations du contaminant (chroniques et aigues) et différents temps d’exposition. L’expérience de contamination de l’huitre creuse par le BaP a été réalisée dans un but comparatif avec la palourde japonaise.

1. COLLECTE ET CONDITIONNEMENT DES BIVALVES

Les palourdes (R. philippinarum) utilisées pour les différentes expériences ont été collectées dans le bassin d’Arcachon (site : Banc d’Arguin). Les huîtres (C. gigas) ont été obtenues auprès d’ostréiculteurs locaux et provenaient aussi du bassin d’Arcachon. Les expériences de contamination in vivo ont été réalisées à la Station Marine d’Arcachon.

Avant toute expérimentation, les bivalves ont été maintenus en stabulation pendant 4 semaines au laboratoire. Les animaux ont été placés dans des bacs alimentés en eau de mer en circuit ouvert. Ils ont été soumis à la photopériode naturelle. Pour chaque expérience, après stabulation, une acclimatation de 5 jours minimum a été effectuée avant de commencer la contamination. L’acclimatation était dans les mêmes conditions (Température, luminosité, salinité, pH) que celles des expériences de contamination.

Les différentes expériences ont été réalisées en conditions contrôlées de température (15°C). La salle de travail a été rendue hermétique à la lumière extérieure et la photopériode (L:D 12:12) réalisée via des néons (MASTER TL-D Xtra 36W/865 1SL, Philips, France). Tous les bacs expérimentaux ont été aérés via des bulleurs d’aquarium munis de capacitance pour éliminer les vibrations. En outre, afin d’éviter toute perturbation du comportement spontané des animaux, les expériences ont été effectuées sur des dispositifs anti-vibratoires. Dans les expériences concernant les palourdes on a utilisé, dans les bacs, du sable propre commercialisé comme substrat (5 cm de profondeur) pour ces animaux vue leur mode de vie.

2. PROTOCOLE EXPERIMENTAL

2.1. Expérimentation n°1 : Contamination des palourdes par le BaP via la voie trophique

2.1.1. Culture et contamination d’algues Isochrysis galbana

L’algue Isochrysis galbana est une microalgue dinoflagellé, de petite taille (2 à 5 µm) et de couleur brune. Elle est caractérisée par sa forme ovoïde, ses deux flagelles lisses et un haptonème très court dit « vestigial ». Les cellules sont habituellement recouvertes de minuscules écailles organiques (0,2 à 0,4 µm). Elle représente un aliment de grande importance pour les larves des bivalves et elle est maintenant largement cultivée pour une utilisation dans l'industrie de l'aquaculture de bivalves (FAO, 2004).

L’algue I. galbana, a été fournie par le Lycée de la mer de Gujan-Mestras (France). Pour des contenants allant jusqu’à 3 litres, I. galbana a été cultivée dans de l’eau de mer filtrée (0.22 µm). Les cultures ont été maintenues à 19 ± 1°C sous une photopériode L:D 14:10.

Pour la contamination d’algue I. galbana, un volume de 120 mL d’une culture d’algue avec une concentration de 3,5 10⁶ cellules/mL a été placé dans chacun des trois Erlenmeyer de 250 mL. La concentration des cellules a été mesurée à l’aide du compteur Coulter Z2 (Beckman Coulter Inc., USA). En raison de la faible solubilité du BaP dans l’eau de mer les solutions ont été préparées dans du DMSO. Deux cultures d’algue ont été exposées à deux concentrations de BaP: C_A = 400 µg/L et C_B = 1000 µg/L, la troisième culture a été exposée au DMSO (Témoin). Le solvant est ajouté dans les cultures d’algue à un pourcentage de 0,1%. Les cultures d'algue ont été exposées au BaP pendant 24 heures en présence d’une faible ébullition pour l’homogénéisation du milieu (figure 38).

2.1.2. Exposition des palourdes aux microalgues prétraitées

Il y a 3 conditions (T, C_A et C_B), pour chaque condition 40 palourdes ont été placées dans un bac (circuit ouvert de l’eau). Les palourdes on été alimenté, chaque jours et durant une semaine (7 jours), par une concentration d’algue de 10⁶ cellules/mL pendant 4 heures à raison de 60 mL/heure (240 x 10⁶ cellules/bac/jours) (figure 22). Pendant l’étape d’alimentation le circuit d’eau était fermé durant 5 heures. L’alimentation commençait à 11 heures soit 3 heures après le début de la photopériode coïncidant à peu près à une distribution

optimale de l’ouverture des valves chez les animaux. L’apport d’algues vers les bacs expérimentaux était régulé par une pompe péristaltique (Gilson, USA) depuis chaque Erlenmeyer contenant 240 mL de culture d’algue prétraitée.

Figure 22 : Photo montrant le système expérimental de contamination des palourdes R.

philippinarum par le benzo(a)pyrène via la voie trophique.

2.2. Expérimentation n°2 : Exposition des palourdes à des concentrations chroniques de BaP via l’eau de mer

Dans cette expérience les palourdes R. philippinarum ont été exposées à de l’eau de mer contaminée par deux concentrations de BaP : 2 µg/L et 5 µg/L). Le lot contrôle des palourdes a été exposé à l’eau de mer contenant du DMSO (solvant de solubilisation du BaP. Dans chaque aquarium, 40 palourdes ont été placées dans un volume de 40 L d’eau de mer (figure 40). Le volume du solvant (DMSO) ajouté dans les aquariums est à 0,0005% du volume total de l’eau. Dans cette expérience, il y a 3 conditions : Témoin (DMSO) = eau de mer +DMSO, CA = 2 µg BaP/L et CB = 5 µg BaP/L. L’expérience de contamination a durée 7 jours sans apport artificiel de nourriture, durant lesquelles l’eau de mer dans les aquariums a été renouvelée et contaminée chaque jour.

2.3. Expérimentation n°3 : Exposition des palourdes à des concentrations aiguës de BaP via l’eau de mer

Dans cette expérience les palourdes ont été exposées à l’eau de mer contaminée par des concentrations aiguës de BaP (solubilisé dans le DMSO). Il y a 6 conditions : Témoin = eau de mer, Témoin (DMSO) = eau de mer + DMSO, C1 = 400 µg BaP/L, C2 = 700 µg BaP/L, C3 = 1000 µg BaP/L et C4 = 1300 µg BaP/L. Pour chaque condition, 20 palourdes ont été placées dans un aquarium contenant 20 L d’eau de mer. Le volume du solvant (DMSO) ajouté dans les aquariums est à 0,01% du volume total de l’eau. L’expérience d’exposition a été réalisée pendant 7 jours durant lesquelles l’eau de mer dans les aquariums a été renouvelée et contaminée chaque jour.

2.4. Expérimentation n°4 : Etude cinétique de l’exposition des palourdes au BaP

Dans cette expérience, les palourdes ont été exposées à une seule concentration de BaP (10 µg/L). Les palourdes témoins ont été exposés à l’eau de mer avec du DMSO. Les bivalves ont été exposés au BaP durant différentes périodes : 1 jour, 3 jours, 7 jours et 14 jours. Pour chacune des deux conditions (Témoin (DMSO) et 10 µg BaP/L), 40 palourdes ont été placées dans un aquarium contenant 40 L d’eau de mer (figure 41). Le volume du solvant (DMSO) ajouté dans les aquariums est à 0,001% du volume total de l’eau. A t = 0, 10 palourdes ont été disséquées. A la fin de chaque période d’exposition citée ci-dessus, 10 individus ont été retirés des aquariums et disséquées.

2.5. Expérimentation n°5 : Exposition des huîtres à l’eau de mer contaminée par le BaP

Dans cette expérience, 20 huîtres creuses (Crassostrea gigas) ont été placées dans des aquariums contenant 20 L d’eau de mer et dans les mêmes conditions (photopériode, température, salinité) que celles pour les expériences concernant les palourdes (figure 42). Les huitres ont été exposées au BaP solubilisé dans le DMSO. Le facteur de contamination est l’eau de mer. Le volume du solvant (DMSO) ajouté dans les aquariums est à 0,01% du volume total de l’eau. Dans l’expérience, il y a sept conditions : Témoin = eau de mer, Témoin (DMSO) = eau de mer + DMSO, C1 = 5 µg BaP/L, C2 = 20 µg BaP/L, C3 = 100 µg BaP/L, C4 = 400 µg BaP/L et C5 = 1000 µg BaP/L. La durée de l’expérience de contamination est de 7 jours.

2.6. Dissection des bivalves

A la fin de chaque expérience, les bivalves (palourde ou huître) sont retirées des aquariums et disséquées rapidement, les branchies et les glandes digestives sont conservées à -80°C pour les analyses biochimiques et de génotoxicité. Concernant les analyses de l’expression génétique, les organes sont placés dans un tampon contenant des inhibiteurs de ribonucléases (RNA later, Qiagen), conservés une nuit à 4°C puis stockés à -80°C jusqu’à la réalisation des analyses. Les tissus mous des palourdes qui ont servi pour le dosage chimique sont conservés à -80°C. Pour l’expérimentation n°1, des cultures de microalgues traitées sont filtrées à travers des papiers filtre Whatman en fibre de verre de 47 mm de diamètre et conservées à -80°C.