Applications des puces pour la génomique

De nombreuses applications des puces se développent pour l’étude du génome des organismes en dehors de la simple expression des gènes. La description ci-dessous reste succincte et non exhaustive puisque le reste de cette thèse ne porte pas sur ses applications. On pourra se référer à la revue de Mockler et al. (Mockler, 2005) pour de plus amples détails.

2.4.1. Etude du polymorphisme

Au départ, les puces n’ont pas été mises au point afin d’étudier le niveau d’expression des gènes mais afin de séquencer les génomes. Grâce aux puces à ADN, différents aspects génomiques sont étudiés.

Ces expériences requièrent parfois l’utilisation de puces génomiques, c’est-à-dire des puces où sont représentées à la fois des séquences de gènes et des séquences intergéniques.

En 1988-89 Fodor et al et Southern et al. de la société Affymetrix ont développé une méthode de séquençage par hybridation (sequencing by hybridization SBH). Le gène étudié est considéré comme un ensemble de plusieurs séquences chevauchantes dont la détermination simultanée puis l’assemblage permettent de reconstituer la séquence (Hacia, 1999). Pease et al. en 1994 ont complété cette technologie. Afin d’avoir des détails sur les techniques existantes et sur leurs utilisations, on peut se référer à la revue (Hacia, 1999). Les puces à ADN sont actuellement utilisées pour le re-séquençage afin d’élucider les différences entre des séquences d’origines différentes. Plus particulièrement, on recherche des mutations entre différents individus ou populations comme le séquençage de différentes souches de streptocoques afin d’adapter les traitements aux infections (Davignon et al., 2005).

Des puces à oligonucléotides ont été fabriquées afin d’identifier les polymorphismes sur une base spécifique (single nucleotide polymorphism ou SNP). Les oligonucléotides sont organisés en tétrades au sein desquelles une séquence est strictement identique à celle de type sauvage alors que les trois autres sont caractérisées par une substitution de base localisée au milieu de la séquence. Ces puces ( Lipshutz, 1999) permettent la détection de différents allèles ainsi que leurs positions (génotypage) mais sont inadaptées à l’étude de polymorphisme long comme des délétions ou des insertions. Plusieurs génotypages ou criblages de mutations ont été effectués grâce à cette technique (Ahrendt et al., 1999) (Wang et al 1998) (Winzeler et al., 1998) hrendt . La revue (Shi, 2001) récapitule l’ensemble des techniques utilisées actuellement pour la détection de SNP dont les puces à ADN Les puces peuvent également être utilisées afin d’étudier la séquence d’organismes proches de celui pour lequel elles ont été conçues. Jusqu’à présent, la séquence complète du génome n’est disponible que pour un petit nombre des systèmes modèles (Renn et al., 2004). Pour les organismes non modèles, l’approche la plus accessible est l’utilisation de puces à ADNc afin d’établir des différences de séquences (insertion/délétion) avec des organismes proches. Cette application est également étendue à la recherche de régions délétées ou insérées entre différentes souches ou populations. Lashkari et al. ont présenté des puces permettant la comparaison génomique de deux souches de levure. Après hybridation de l’ADN génomique marqué, les gènes pour lequel le signal est extrêmement faible sont d’éventuels gènes délétés ou extrêmement divergents entre différentes souches. Une autre technique, les puces CGH (comparative genome hybridization), puces génomiques, permettent également l’identification de grandes délétions/ insertions. Comme des cancers peuvent se caractériser par des délétions/ insertions ou amplifications de certaines séquences, les puces CGH ont été utilisées sur des lignées cellulaires tumorales (Kallioniemi et al., 1992) (Pollack et al., 1999) et ont permis de détecter des séquences amplifiées et délétées dans différents types de cancer.

2.4.2. Analyse des mécanismes de régulation d’expression (hybridation d’ADN) Toujours grâce à l’hybridation de l’ADN aux puces, des études se sont focalisées sur une échelle plus réduite, le gène et ses environs. Les puces ont ouvert la voie à des cartographies des motifs de régulations de l’ADN à grande échelle. On cherche à identifier des régions d’ADN se liant avec les facteurs de transcription. Pour cela, la chromatine liée à des protéines est immunoprécipitée grâce à des anticorps spécifiques de la protéine étudiée. La séquence est ensuite identifiée grâce à des puces génomiques. Cette technique, ChIP-on-chip, et les découvertes réalisées grâce à elle sont décrites en détail dans les revues (Rodriguez and Huang, 2005) (Hanlon and Lieb, 2004). L’étude de la liaison de deux facteurs de transcription ( Iyer et al., 2001) a montré leur implication dans l’activation de gènes qui font partie de deux voies métaboliques différentes: la synthèse de la membrane cellulaire et la réplication et la réparation de l’ADN. Cette spécialisation des facteurs de transcription permet d’expliquer la régulation de processus cellulaires indépendants.

Globalement, les puces génomiques permettent donc d’aborder le système de régulation d’expression de manière complètement nouvelle. Ainsi, une grande partie des sites de fixation de facteurs de régulation identifiés grâce à cette technique se situent en dehors des régions promotrices prédites jusqu’alors (Mockler et al., 2005) (Cawley et al., 2004).

Une autre application concerne la régulation de l’expression des gènes via la méthylation des cytosines de l’ADN. Plusieurs techniques sont utilisées afin d’identifier les sites de méthylation de l’ADN (cf. la revue (Mockler et al., 2005)). Globalement, une réaction préalable permet de différencier les cytosines où l’ADN est méthylé de celles où il ne l’est pas. Des enzymes de clivage pour les ADN non méthylés ou la conversion des cytosines en uracile grâce au bisulfate de soude sont deux types de réactions utilisées. Ces morceaux d’ADN méthylés sont ensuite identifiés grâce à l’hybridation sur des puces.

2.4.3. Analyse au niveau de l’ARN et des mécanismes d’expression

Les puces à ADN génomique permettent de découvrir de nouveaux gènes (Mockler et al., 2005) et de définir leur structure (intron/exons pour les eucaryotes). Des puces génomiques qui représentent soit l’ensemble du génome soit des portions du génome régulièrement espacées permettent la détection des portions d’ADN transcrites. Pour l’homme et le génome des plantes, les puces génomiques révèlent que certaines régions considérées comme non codantes sont effectivement exprimées (Kapranov et al., 2002) (Kampa et al., 2004) (Yamada et al., 2003). Parmi les séquences exprimées, environ 50% étaient annotées comme étant des gènes alors que 50% ne présentaient aucune annotation codante. La revue de Johnson et al.

(Johnson et al 2005) permet d’approfondir cette question et montre notamment qu’une partie des séquences transcrites sont en fait des ARN non traduits ou correspondent à des transcrits anti-sens.

Une autre application des puces à ADN est l’analyse des transcrits alternatifs difficilement prédits par les programmes actuels de la bioinformatique. Cela a été appliqué chez la levure (Castle et al., 2003). La technique n’est pas encore sans défaut. On peut se référer à la revue afin de connaître ses limites et les différentes applications existantes (Lee and Roy, 2004). L’étude des séquences cibles des protéines liant l’ARN permet de comprendre les mécanismes de modifications post-transcriptionnelles grâce aux puces. Cette analyse peut être couplée avec l’épissage alternatif afin de comprendre comment les différents ARNm sont synthétisés (Castle et al 2003). Le principe est simple et ressemble à celui de ChIP-on-chip : les séquences d’ARN qui se lient avec une protéine sont purifiées par immunoprécipitation ou par colonne d’affinité. La puce à ADN permet ensuite d’identifier ces séquences. La revue (Mata et al. , 2005) référence l’ensemble des applications des puces quant à l’identification des séquences d’association entre l’ARN et des protéines.

Enfin, de nouvelles puces sont actuellement développées afin d’étudier l’effet des ARN interference (ARNi) sur les cellules (Wheeler et al., 2005). Des lots d’ARNi sont fixés sur la puce puis mis en présence de cellules à transfecter. Le but est d’observer les phénotypes obtenus sur les cellules transfectées par un ARNi particulier.