Analyses lipidiques

a) Protocole d’échantillonnage

Un premier test sur une quinzaine d’échantillons, répartis tout au long de la séquence d’IGA- 2011, a été réalisé à l’ISTO sur une durée totale d’analyses d’un mois. Au vu des premiers résultats très encourageants, une nouvelle quinzaine d’échantillons ont été analysés. Au total, 35 échantillons ont été traités au laboratoire ISTO (Université d’Orléans) pour réaliser un inventaire moléculaire complet de la séquence Iga-2011 en se focalisant principalement sur les deux phases agropastorales connues (résolution de 30 ans pour la période médiévale et de 5 ans pour le dernier siècle).

Partie I : Evolution et réponses environnementales des activités agropastorales médiévales et actuelles sur

les écosystèmes du sud du Groenland à partir d’une approche moléculaire 61 b) Extraction lipidique

Les analyses de géochimie organique se sont déroulées en cinq principales étapes débutant par la phase d’extraction (Figure 19). À partir d’environ 2 g sec de sédiments totaux lyophilisés, tamisés à 2 mm et non broyés, les lipides de chaque échantillon ont été extraits de manière automatique en utilisant une ASE 200 (Dionex©), sous une pression de 1000 Psi, une température de 100°C et un mélange de solvants organiques de type dichlorométhane (DCM)/méthanol (MeOH ; Figure 19).

c) Séparation des fractions neutre/acide/polaire (N/A/P)

Chaque extrait lipidique est ensuite séparé en fractions neutre/acide/polaire (N/A/P) par chromatographie liquide sur mini-colonnes, remplies de silice greffée de groupements aminopropyles, selon le protocole établi par Jacob et al. (2005). Les fractions neutres sont obtenues en éluant l’extrait lipidique total avec un mélange de DCM/isopropanol. Les fractions acides sont, par la suite, éluées à l’aide d’un mélange éther/acide formique suivi par une solution d’éther pur. Enfin, pour récupérer la fraction polaire, une simple élution au MeOH est suffisante (Figure 19). L’ensemble des séparations N/A/P (105 en tout, en considérant les 35 échantillons de départ) ont été réalisées manuellement. Certains tests ont cependant été réalisés de manière automatique à l’aide d’une ASPEC GX-271.

d) Séparation de la fraction neutre

Chacune des fractions neutres est ensuite re-séparée en six autres fractions, toujours par chromatographie liquide sur mini-colonnes mais cette fois-ci remplies de silice désactivée avec 5% d’eau, selon le protocole développé par Lavrieux et al. (2011 ; Figure 19) :

 la 1ère

fraction qui regroupe des hydrocarbures aliphatiques et cycliques, est éluée avec de l’heptane ;

 la 2ème

fraction, contenant des hydrocarbures aromatiques, est obtenue à l’aide d’heptane puis d’un mélange heptane/toluène ;

 la 3ème

fraction, regroupant les éthers, est aussi éluée par un mélange heptane/toluène, avec cette fois-ci une proportion volumique d’heptane plus importante ;

 la 4ème

fraction qui rassemble les cétones et les alcénones, est obtenue par élution d’un mélange d’heptane/acétate d’éthyle ;

 la 5ème

fraction qui réunit les alcools, stérols et triterpénols, est éluée à partir de ce même dernier mélange de solvants comprenant toutefois une proportion volumique d’heptane plus grande ;

 enfin, la 6ème

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e) Séparation de la fraction acide

Préalablement à leur séparation, une estérification des acides est nécessaire pour permettre l’isolation des acides biliaires. Cette estérification protège la fonction acide à partir d’une méthylation. À la fraction acide est additionnée un mélange de MeOH anhydre et d’acétyle chloride (MeCOCl). Ce mélange est ensuite chauffé à l’étuve pendant une heure à 55°C. Il est finalement séparé en trois différentes fractions avec des solvants de polarité croissante, selon le même mode opératoire que la fraction neutre (Zocatelli et al., 2012 ; Figure 19).

 la 1ère

fraction des acides regroupe les acides gras méthyl-éthers (FAMES), est obtenue à partir d’une élution de DCM ;

 la 2ème

fraction, où sont concentrés les hydroxy-acides linéaires, diacides et acides biliaires, est éluée par un mélange DCM/isopropanol ;

 la 3ème

et dernière fraction contenant les molécules polaires est obtenue par le même solvant de la 6ème fraction des neutres, le MeOH.

La séparation des extraits lipidiques, puis des fractions neutre et acide est une étape nécessaire pour réduire la diversité trop importante des molécules et assurer une identification et quantification précise de chaque composé lipidique. En comptant les séparations N/A/P, neutre et acide, un total de 350 séparations a été réalisée à partir des 35 échantillons de départ, correspondant au final à 315 fractions.

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Fi gu re 19 : S ch é ma r é cap itu lati f d e la sé p ar ati o n d e s c o mp o sé s li p id iq u e s

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f) Identification et quantification des composés organiques

L’ensemble des fractions neutres et acides (à l’exception de leur fraction contenant les molécules polaires) ont été analysées par chromatographie gazeuse (Trace GC Ultra, équipé d’un injecteur automatique AS 3000) couplée à un spectromètre de masse (TSQ Quantum XLS) dont le fonctionnement est décrit dans la figure 19 et les paramètres techniques regroupés au sein du tableau 1.

Paramètres de la chromatographie gazeuse (GC) Paramètres du spectromètre de masse (SM) Température initiale = 40°C pendant 1 min Température source = 280°C

Palier de chauffe n°1 de 40 à 120°C à 30°C/min Scan entre 50 Da et 600 Da Palier de chauffe n°2 de 120 à 300°C à 3°C/min Analyse en impact électronique Chauffe à 300°C pendant 60 min Eionisation= 70 eV

Gaz vecteur : He à 1mL/min

Colonne Trace Gold (Thermo) TG-5MS 60 m*0.25 mm (diamètre interne)*0.25 µm (film)

Injecteur à diviseur en mode splitness

Tableau 1 : Paramètres techniques de la chromatographie gazeuse couplée à un spectromètre de masse (CG-SM).

Avant leur passage en CG-MS, la 5ème fraction des neutres contenant les stérols et la 2ème fraction des acides sont silylées à l’aide d’un mélange de N,O-bis(trimethyl)trifluoroacetamide (BSTFA)/pyridine puis chauffées à 60°C pendant une heure afin que les pics obtenus pendant l’analyse soient mieux formés, assurant une meilleure quantification des molécules présentes dans ces fractions.

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Fi gu re 20 : S ch é ma d u f o n cti o n n e me n t d e la C G -MS d ’ap rè s Fo u rmo n t ( 2000 , p u b lic at io n p e rso n n e lle ).

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Pour chaque chromatogramme (245 au total), l’ensemble des molécules prédominantes (100 en moyenne) ont été identifiées puis quantifiées à la main à l’aide des données de la bibliographie (Elhmmali et al., 1997 ; Bull et al., 2001 ; Tyagi et al., 2008 ; Jacob et al., 2009 ; Lavrieux et al., 2011 ; Figure 21). A partir de l’aire des pics obtenue, les molécules sont exprimées en concentrations (ng/g de sédiment). Pour cela, l’aire du pic de la molécule a été normée par l’aire du pic du standard injecté dans chaque fraction(le 5α-cholestane), toutes deux sur le courant ionique total (TIC), puis multipliées par le rapport quantité de standard injecté sur masse de l’échantillon extrait. Les concentrations des molécules ont ensuite été converties en flux en les multipliant par le taux de sédimentation et la densité sèche, divisés par le carbone organique total (COT) afin de corriger les tendances d’éventuels apports instantanés de sédiments et/ou de matières organiques.

Figure 19 : A- Chromatogramme et spectromètre de masse du standard injecté. B- Chromatogramme et spectromètre de masse d’hydrocarbures aromatiques détectés dans la 2ème fraction des neutres.

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