ANALYSES INFRAROUGES

A. Principe de l’analyse

Les spectroscopies vibrationnelles comme la spectroscopie infrarouge impliquent l’utilisation de la lumière pour examiner le comportement vibrationnel des systèmes moléculaires, grâce à des expériences d’absorption ou de dispersion de la lumière. L’énergie vibrationnelle des molécules et des cristaux se situe approximativement dans le domaine d’énergie 0-60 kJ/mol, soit 0-5000 cm-1 ce qui correspond à l’énergie de la lumière dans la région infrarouge du spectre. Une expérience d’absorption infrarouge consiste donc en l’absorption directe de lumière par les vibrations moléculaires. Cette technique concerne principalement les espèces moléculaires pour lesquelles il existe un moment dipolaire. Les liaisons chimiques animées d’un mouvement de vibration ou de rotation permettent de faire varier légèrement leur moment dipolaire, ce phénomène induit alors la création d’un champ variable qui peut interagir avec le champ électrique de l’onde infrarouge incidente (figure 19). Dans le cas où la fréquence de l’onde incidente est exactement égale à la fréquence de vibration ou de rotation de la molécule, un transfert d’énergie se produit avec pour effet une modification de l’amplitude de la vibration moléculaire et l’absorption de l’onde infrarouge. Les vibration permettant une analyse par infrarouge peuvent être classées en deux grandes catégories : les vibrations d’élongation et les vibrations de déformation angulaire.

Figure 19 : Modes de vibration moléculaire. Le signe « + » signifie un mouvement vers le dessus de la feuille, le signe « - » un mouvement vers le dessous de la feuille.

Les pics d’adsorption peuvent donc être associés à la présence de groupes structuraux particuliers dans l’échantillon. En ce qui concerne les molécules organiques ou biologiques, l’analyse IR présente l’avantage, par rapport aux autres techniques de ne perturber que très peu l’environnement chimique de la cellule en limitant les manipulations de l’échantillon et donc l’introduction de nouveaux artefacts (GIORDANO et al., 2001).

Dans notre travail l’analyse infrarouge a été utilisée pour caractériser d’un point de vue qualitatif les groupes organiques présents à la surface ou à l’intérieur des cellules de diatomées.

Au cours des mesures infrarouges sur les diatomées, plusieurs problèmes peuvent se présenter. La principale difficulté est, comme l’XPS, la représentativité des résultats analytiques obtenus sur des cellules séchées puisque la plupart des techniques d’analyse infrarouge se font avec un échantillon sec dilué dans une poudre de KBr. Certains dispositifs permettent l’analyse directe en solution mais il faut alors utiliser d’autres solvants que l’eau qui présente une forte absorption infrarouge. La seconde difficulté est plus spécifique à nos recherches puisqu’elle concerne la profondeur d’analyse durant les mesures. En effet, il est important de ne pouvoir analyser que la surface des diatomées et non pas les différents organites présents à l’intérieur de la cellule. Ainsi, trois techniques d’analyses ont été effectuées, toutes avec leur spécificité et leur profondeur d’analyse : en transmission (FT-IR), par mesure de la réflexion diffuse (DRIFT) et réflexion totale atténuée (ATR).

B. Protocoles utilisés

Les mesures Infrarouges ont été effectuées en collaboration avec les chercheurs du Laboratoire d’Environnement et Minéralogie de l’INP de Nancy (J. Mielczarski et O. Barres).

1. Mesures en transmission (FT-IR)

Ce genre d’appareillage, qui utilise un traitement par les transformées de Fourier permet d’obtenir un rapport signal/bruit environ dix fois supérieur à celui des appareil dispersifs, plus anciens. Avec ce dispositif le calcul des longueurs d’onde, effectué avec une grande précision, permet la comparaison de spectres, de plus la résolution est constante sur tout le domaine étudié. Les mesures avec les spectromètres à transformée de Fourier se caractérisent notamment par la présence d’un interféromètre (souvent de type Michelson)

remplaçant le monochromateur placé entre la source et l’échantillon. Dans cette étude, les mesures ont été effectuées avec un Bruker IFS88.

L’échantillon à analyser se présente sous la forme d’une pastille de KBr contenant les cellules séchées de diatomées. Le KBr a la propriété de fluer à froid lorsqu’il est soumis à une pression suffisante et de former une pastille transparente ou translucide. Etant un composé ionique, il n’absorbe par le rayonnement infrarouge.

Cette technique a été appliquée à la détermination de la composition chimique globale des diatomées. L’analyse portant sur la totalité des cellules, l’information obtenue concerne à la fois les groupements surfaciques, ceux qui nous intéressent, mais aussi sur les groupements présents à l’intérieur de la cellule, constitutifs des différents organites de la diatomée. Les données obtenues, si elles nous donnent une indication sur les groupes fonctionnels présents, ne permettent toutefois pas d’être directement exploitées dans notre étude et des techniques plus adaptées à l’analyse exclusive des surfaces sont nécessaires.

2. DRIFT (Réflexion diffuse)

La spectrométrie infrarouge par transformée de Fourier à réflexion diffuse s’effectue sur un échantillon sous forme de poudre. L’utilisation des mesures de réflexion diffuse s’est généralisée à partir des années 1970 avec l’apparition des appareils à transformée de Fourier car le signal réfléchi par la poudre est très faible. La réflexion diffuse se produit lorsque le rayonnement frappe la surface d’une poudre finement divisée. En raison du grand nombre de grains et de l’orientation aléatoire de leurs surfaces, le rayonnement est réfléchi dans toutes les directions. Plusieurs modèles ont été développés pour tenter de décrire quantitativement l’intensité du rayonnement diffus réfléchi. Le modèle le plus utilisé est celui de Kubelka et Munk (KUBELKA, 1948).

Cette technique d’analyse consiste à collecter, au moyen de miroirs plans et elliptiques, une grande partie de la lumière diffusée par l’échantillon contenu dans une pastille de KBr en poudre.

Le seul rayonnement analysé étant celui réfléchi par la surface de l’échantillon (voir la figure 20), cette technique est ainsi mieux adaptée à la caractérisation des surfaces de diatomées que l’Infrarouge classique en transmission.

Les spectres ont été obtenus à l’aide d’un spectrophotomètre Bruker IFS88 équipé d’un détecteur MCT (Mercure Cadmium Tellurium) qui consiste en une cellule photoélectrique refroidie à l’azote. La chambre du spectrophotomètre est purgée à l’air sec sans CO2. Pour effectuer une mesure, un échantillon est prélevé dans la suspension de diatomées, puis les diatomées sont séparées par décantation et placées sur un filtre en papier afin d’enlever l’excès de solution. Ensuite, 50 mg des diatomées semi sèches ainsi obtenues sont mélangées à 350 mg de KBr et placées dans la chambre de mesure. Les spectres sont acquis avec une résolution de 4 cm-1 dans la région de 4000 à 500 cm-1. Ils sont obtenus en faisant le rapport de la réflectance de l’échantillon à celle du système. On notera que les spectres sont automatiquement corrigés pour la présence éventuelle d’eau atmosphérique.

Figure 20: Schéma de l’appareillage utilisé lors de mesures de réflexion diffuse

3. ATR (Réflexion Totale Atténuée)

Cette méthode d’analyse est basée sur les propriétés de réflexion des ondes (ici Infrarouges) au passage d’une interface. A partir d’un angle particulier d’incidence la réflexion du rayonnement est totale. Au cours de ce phénomène, le rayonnement pénètre légèrement dans le milieu le moins dense avant que la réflexion ne se produise. La profondeur de pénétration dépend alors de trois facteurs : l’indice de réfraction des deux matériaux en présence, l’angle du faisceau incident et la longueur d’onde du rayonnement. Si le matériau du milieu le moins dense a des propriétés d’absorption en Infrarouge, on observe alors une atténuation du faisceau aux longueurs d’onde des pics d’absorption. Ce sont ces atténuations qui vont permettre d’établir le spectre Infrarouge du matériau le moins dense (figure 21).

Les spectres d’ATR ont été obtenus sur un appareil FT-IR Bruker IFS88 équipé d’un détecteur MCT (Mercure Cadmium Tellurium) à l’aide d’un module ATR. Le spectromètre est purgé avant les mesures avec de l’air sec sans CO2 (filtre Balston) dans une pièce à environ 25°C. Les spectres ont été effectués avec une précision de 4 cm-1 sur environ 200 accumulations dans la région d’infrarouge moyen : 4000-500 cm-1. L’unité d’intensité a été défini comme étant égale à -log(R/R0) où R et R0 sont la réflectivité du système avec et sans échantillon respectivement. L’élément réflecteur est constitué d’un cristal de germanium ou de ZnSe avec un angle d’incidence de 45° par rapport à la chambre contentant la suspension de diatomées. Lors des analyses, le cristal est maintenu en contact direct avec la suspension de diatomées grâce à une chambre externe étanche. L’utilisation de deux réflecteurs différents pendant les mesures a permis de faire varier la profondeur de pénétration du rayon incident à la surface des diatomées : de 0.6 à 1.3 μm pour ZnSe et de 0.2 à 0.6 μm pour Ge. L’incertitude sur les profondeurs de pénétration est d’environ 30%.

L’avantage de cette méthode par rapport à l’Infrarouge classique est de permettre d’analyser seulement les premières centaines de nanomètres de la surface des diatomées vivantes: le spectre infrarouge n’est donc plus effectué sur la totalité de la diatomée mais seulement sur les groupements surfaciques organiques qui contrôlent les réactions acido- basiques et d’adsorption des métaux. De plus ces mesures peuvent être réalisées in situ sur une suspension de diatomées en solution. Les concentrations des suspensions de diatomées analysées dans ce travail étaient comprises entre 50 à 100ghumide/L. On notera que si la spectroscopie ATR a déjà été appliquée, dans plusieurs travaux, à l’étude des surfaces de bactéries, c’est la première fois qu’elle est appliquée aux diatomées.

Figure 21 : Schéma de l’appareillage utilisé lors de mesures de réflexion totale atténuée