Chapitre II. Matériels et Méthodes
8 Analyses biologiques
8.1 Détection et numération des microorganismes
Des analyses microbiologiques ont été réalisées sur les échantillons d'argilite plantés et non plantés.
8.1.1 Extraction d’ADN et Quantification du nombre de copies par q-PCR
L‘ADN ribosomique fongique et bactérien de l‘expérimentation in situ et en conditions de laboratoire a été extrait à l‘aide du kit d‘extraction FastDNA® Spin Kit for Soil (MP Biomedicals) selon la méthode décrite par le fournisseur, avec un volume final d‘élution de 80 µl pour 0,5 g de COx. Une quantification sélective de l‘ADN bactérien 16S et fongique 18S, avec les couples d‘amorces 968F et 1401R et Fung5F et FF390R respectivement, a été
réalisée par q-PCR (Cebron et al., 2011) (Tableau 4). Les réactions d'amplification (20 µl de volume final) ont été effectuées en utilisant 10 µl de iQ SYBR SuperMix verte (Bio-Rad), 0,8 µl de chaque amorce (10 µM), 0,4 µl de BSA à 3% (sérum albumine bovine) en solution, 0,2 µl de DMSO (diméthylsulfoxyde), 0,08 µl de protéine gp 32 du bactériophage T4 (MP Biomedicals, France) et 1 µl d'ADN dilué, ce qui correspond à 7,8 à 3,1 ng. Les conditions de PCR étaient les suivantes: 95 ° C pendant 5 min, 40 cycles de 95 ° C pendant 30 secondes, 54 ° C pendant 30 secondes et 72 ° C pendant 30 secondes et une étape d'extension finale à 72 ° C pendant 7 min. Les qPCR ont été réalisées avec des échantillons d‘ADN dilués au tiers à l‘aide d‘un thermocycleur en temps réel CFX96 (Biorad) et les conditions suivantes : à partir de 51 ° C à 95 ° C, augmentation de 0,5 ° C toutes les 10 secondes, acquisition de la fluorescence (Cébron et al 2008; Thion et al., 2012). Les données ont été exprimées en nombre de copies de gène d‘ADNr 16S et 18S g-1.
Tableau 4 : Amorces, températures d’hybridation (TH), nombre de cycles (C) et tailles attendues des fragments (TF) de la PCR
Cible Amorces Séquences 5’⟶ 3’ TH (°C) C TF (pb) Références
ADNr 16S 1401R 968F GAACGCAAGAACCTTAC CGGTGTGTACAAGACCC 56 35 430 (Felske et al., 1998)
ADNr 18S FF390R Fung5F GGGAACCAGGACTTTTAC GAGGTCTGTTCGTTATCG 50 35 550 (Lueders et al., 2004)
8.1.2 Dénombrement des bactéries cultivables par NPP
Un dénombrement des bactéries hétérotrophes cultivables a été réalisée par la technique du Nombre le Plus Probable (NPP). Cette méthode définit les bactéries cultivables par leur capacité à se développer dans un milieu de culture riche de type LB (Luria-Bertani). Sur ces tests réalisés en microplaques, leur croissance est révélée par une variation de la densité optique (trouble opalescent) mesurée à 620nm par un spectrophotomètre. L‘échantillon de COx à analyser est délité dans de l‘eau osmosée sous agitation pendant une heure. La suspension à 1% (1g pour 100 ml) est ensuite diluée en cascade plusieurs fois (série de dilution au dixième). Chaque dilution sert ensuite à ensemencer une série de puits (24) d‘une microplaque contenant le milieu LB. Après une période d‘incubation optimale de 24 à 72 h à 28°C ± 0.5°C, les mesures photométriques à 600 nm sont réalisées dans chaque puits. Les puits présentant une variation positive de densité optique supérieure à 0.1 unité par rapport au blanc (milieu seul non ensemencé) sont considérés comme positifs. Le Nombre le Plus Probable (NPP) est ensuite estimé par calcul à partir du nombre de puits positifs par dilution
avec l‘aide d‘un programme dédié (MPN calculator, Version 4.04, USA EPA). L‘estimation statistique restitue la densité moyenne des bactéries dans l‘échantillon (bact/ml ou bact/g). Des intervalles de confiance (à 95%) sont associés à cette estimation moyenne de la densité bactérienne dans l‘échantillon.
8.2 Estimation des paramètres mycorhiziens des racines de lavandins
L‘estimation du taux de mycorhization de racines de lavandins prélèvées in situ (verses) ou en conditions contrôlées de laboratoire (microcosmes en pots) a été réalisée par l‘observation au microscope en fond clair et à faible grossissement de fragments de racines préalablement colorées au bleu Trypan pour déceler la présence de mycélium. La proportion de cortex racinaire colonisé par les champignons mycorhiziens est estimée par la méthode de Trouvelot et al (1986). Elle est basée un système de notation pour estimer la colonisation par le champignon (6 classes) ainsi que la présence d‘arbuscules (4 classes).
8.2.1 Coloration des racines
La coloration au bleu Trypan des racines est réalisée selon le protocole de Koske et Gemma (1989). Des fragments d'un centimètre de racines fraîches, pris au hasard, ont été préalablement lavés à l'eau puis laissés pendant 12 heures dans une solution d'éthanol à 50 %. Les racines ont été ensuite rincées puis décolorées dans une solution de potasse à 5 %. Après 4-5 rinçages, les fragments racinaires ont été placés pendant 12 heures dans une solution d'acide chlorhydrique à 1 % puis ont été mis dans une solution de bleu Trypan à 0,5 % (0,5g de bleu Trypan, 50 ml HCl à 1 %, 500 ml de glycérol à 98 % et 450 ml d'eau) afin de les colorer. Après une demi-journée, les racines sont rincées puis placées dans une solution de décoloration (50 ml d'HCl à 1 %, 500 ml de glycérol à 98 % et 450 ml d'eau) jusqu'à la préparation des lames. Chaque étape de rinçage a été réalisée à l'aide d'eau distillée. Les racines colorées sont placées entre lames et lamelles, avec du glycérol, afin de permettre l‘observation sous microscope optique. Trente fragments racinaires ont été préparés pour chaque échantillon, à hauteur de 10 fragments par lame.
8.2.2 Paramètres d’estimation
Fréquence de la mycorhization F :
( ) N = nombre de fragments observés
Intensité de mycorhization du cortex, M :
N = nombre de fragments observés n5 – n1 = nombre de fragments notés 5 à 1 Teneur en arbuscules de la partie mycorhizée, a :
mA3 à mA1 = % de fragments mycorhizés, m, affectés par les notes A3 à A1 Teneur en arbuscules du système racinaire, A :
M = intensité de mycorhization du cortex
A = teneur en arbuscules de la partie mycorhizée
8.3 Croissance et physiologie des plantes
A la récolte, les racines et les tiges des lavandes et lavandins plantés sur COx sont séparées et lavées à l‘eau distillée. Les biomasses fraîches et sèches des parties aériennes et racinaires ont été mesurées.
8.3.1 Humidité pondérale
L‘humidité pondérale (HP en %) des parties aériennes et racinaires ont été déterminées par différence des masses avant et après séchage en étuve à 60°C durant 72h. La teneur en eau des tissus a pu être calculée selon la formule suivante :
où BF est la biomasse fraîche (en g) et BS et la biomasse sèche (en g)
Le rapport de la biomasse racinaire sèche par la biomasse foliaire sèche (BR/BA) a été déterminé à la suite d‘un séchage en étuve à 60°C durant 72h des parties aériennes et racinaires.
Les croissances des lavandes et lavandins ont été mesurées toutes les deux semaines à l'aide de deux paramètres morphométriques non destructifs : diamètre et hauteur. De manière concomitante à ces mesures, des photographies de chaque plante ont été prises afin d'apprécier la couleur du feuillage, d'estimer leur surface foliaire et d'observer leurs évolutions respectives.