Analyse sur support de carbone graphite poreux (PGC)

Nous avons vu dans le premier chapitre de ce manuscrit que le PGC est une alternative intéressante pour la séparation des catécholamines et plusieurs exemples de séparation de cette famille de molécules ont déjà été répertoriés [13-16]. Des mélanges plus ou moins complexes ont été analysés dans différentes matrices biologiques telles que le plasma [16] ou le cerveau [15]. Ce type de support qui a des propriétés rétentives si particulières a été utilisé avec différentes phases mobiles en association avec une détection UV [13,16] ou par spectrométrie de masse [15].

Références bibliographiques : voir pages 134-135 ⁸⁸ III.2.1. Analyse en mode isocratique

Pour nos premiers essais, nous avons repris les conditions de phase mobile (MeOH/HCOONH4 50 mM pH 2,9 (60/40 v/v)) décrites par Törnkvist et al [15], mais en divisant par 10 la concentration en sel (5 mM). Dans ces conditions, le mélange est mieux résolu que sur la colonne C18 mais il reste tout même la coélution de la paire NA/A (comme observée par Törnkvist) et de la paire DA/DHBA. Nous avons pu remarquer sur PGC des inversions d’ordre d’élution pour certains composés notamment pour les couples 3-MT, S et 5HIAA, HVA par rapport à la colonne C18.

Comme sur la colonne C18, ce sont les composés avec les log P les plus importants (HVA, DOPAC, 5HIAA) qui sont les plus retenus. Le PGC est un support plus rétentif que le C18, des augmentations importantes de rétention sont enregistrées sur PGC pour les composés acides (Tyr, DOPA, DOPAC) et pour les composés indoliques (S, Trp et 5HIAA). La rétention importante de ces composés peut s’expliquer par les particularités du PGC, qui est un support offrant des interactions fortes avec les composés anioniques et avec ceux ayant une structure plane [17,18]. Ces composés ne sont pas élués avec des phases mobiles contenant 10% de modificateur organique et même avec 60% de MeOH dans la phase mobile, les facteurs de rétention restent supérieurs à ceux observés sur C18 avec 10% de MeOH.

Pour l’élution de 5HIAA, nous avons rencontré des difficultés supplémentaires, liées au fait que ce composé possède une structure relativement plane (noyau indolique) et qu’il est sous sa forme anionique à pH 3. Des concentrations importantes en sel (100-150 mM) et un fort pourcentage de modificateur organique (plus de 60% d’ACN) dans la phase mobile sont nécessaires pour son élution (Figure II.5).

0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 0 2 4 6 8 10 12 14 Temps (min) In te n si te ( u A )

Figure II.5. Le 5HIAA à 100 µg.L^-1

Colonne : PGC (L x Ø = 100 x 4,6 mm, 5µm) ; Phase mobile : ACN/HCOONH4 100 mM, pH 2,8, (70/30 v/v) ; Débit : 1 mL.min-1 ; Détection : UV.

Références bibliographiques : voir pages 134-135 ⁸⁹ III.2.2. Choix du modificateur organique

En remplaçant les 60% de MeOH dans la phase mobile par 60% d’ACN, les temps de rétention (tr) de tous les composés ont beaucoup diminué (figure II.6) ce qui entraine la perte de séparation entre les 7 composés : A, NA, DHBA, DA, 3-MT, Tyr et DOPA, tous coélués très proche du volume mort (figure II.7). Cette modification de phase mobile implique aussi des inversions d’ordre d’élution entre Trp et DOPAC d’une part et 3-MT et le couple Tyr, DOPA d’autre part.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 NA A DH BA DA MT DO PA ^DOPA_C ^S HV_A TR P 5HI AA MeOH 60% ACN 60% ACN 30% ACN 10%

Figure II.6. Influence de la nature et du pourcentage de modificateur organique sur la rétention des analytes

Colonne : PGC (L x Ø = 100 x 4,6 mm, 5µm) ; Phase mobile : MeOH ou ACN et HCOONH4

5 mM, pH 2,9 ; Débit : 0,2 mL.min^-1. -10000 190000 390000 590000 790000 990000 1190000 1390000 1590000 1790000 0 2 4 6 8 10 12 5HIAA HVA DOPAC Tr p, S A, NA

DHBA, DA, DOPA, TYR, 3-MT

Temps (min) In te ns ite ( uA)

Figure II.7. Profil de séparation des catécholamines sur PGC

Colonne : PGC (L x Ø = 100 x 4,6 mm, 5µ) ; Phase mobile : ACN/HCOONH4 5 mM, pH 2,8, (60/40 v/v) ; Débit : 1 mL.min^-1 ; Détection : UV.

Références bibliographiques : voir pages 134-135 ⁹⁰

La figure II.6 met en évidence, qu’une diminution du pourcentage d’ACN dans la phase mobile se traduit, comme attendu, par une augmentation de tr pour tous les analytes. Cet effet est d’autant plus important que le tr du composé est élevé. Vu les différences très importantes entres les temps de rétention des premiers composés élués et ceux élués en dernier (les acides), un gradient d’ACN peut être envisagé pour séparer un maximum de composés tout en maintenant un temps d’analyse raisonnable.

III.2.3. Analyse en mode gradient

Pour faciliter la sortie des composés trop retenus (S, Trp, 5HIAA), nous avons augmenté la concentration en sel dans la phase mobile initiale ainsi que la teneur en ACN durant le gradient.

La figure II.8 présente la séparation optimale que l’on peut obtenir en gradient d’élution sur PGC. Si une bonne séparation de NA, A, DA, DHBA, TYR, DOPA et 3-MT peut être réalisée en 12 min, la séparation entre S et Trp n’est pas totale (pas de retour à la ligne de base). De plus, dans ces conditions, le DOPAC donne un pic déformé, très large et confondu dans la dérive de la ligne de base. Quant au 5HIAA, il reste non-élué dans ces conditions. -1000 9000 19000 29000 39000 49000 59000 69000 79000 0 5 10 15 20 25 30

Figure II.8. Séparation des catécholamines sur PGC en gradient

Colonne : PGC (L x Ø = 100 x 4,6 mm, 5µm) ; Phase mobile : A : ACN/HCOONH4 50 mM pH 3 (10/90 v/v), B : ACN/HCOONH4 100 mM pH 3 (70/30 v/v) selon le gradient suivant : de 0 à 30% de B en 15 min, de 30 à 100% de B en 5 min et maintenue à 100% B pendant 5 min puis à 0% B pour le rééquilibrage ; Débit : 1 mL.min^-1 ; Détection : UV.

3-MT S Trp DOPAC HVA pic système DOPA NA A DHBA DA Tyr

Références bibliographiques : voir pages 134-135 ⁹¹

Le gradient d’élution, en plus de permettre la séparation des solutés les moins retenus, offre la possibilité de réduire les coélutions de ces solutés avec ceux indésirables présents dans la matrice en introduisant initialement un palier initial dont la composition serait inferieur à 10 %.

III.2.4. Bilan des conditions d’analyse sur PGC

Par rapport à la silice greffée C18, une plus forte rétention et une meilleure séparation des analytes sont obtenues sur PGC. Des phases mobiles plus riches en modificateur organique sont nécessaires pour l’élution des composés sur cette colonne ce qui présente un avantage pour la détection en SM (meilleure sensibilité).

Les différences importantes de rétention entre les premiers et les derniers analytes élués en mode isocratique nous ont obligés à mettre au point des gradients d’élution. En gradient ACN/HCOONH4, nous avons obtenu pour la première fois une séparation entre la NA et l’A. Sept analytes (NA, A, DA, DHBA, TYR, DOPA et 3-MT) sur les 12 sont séparés en 12 min. En revanche, la séparation entre S et Trp ou l’élution de 5HIAA dans des délais acceptables (moins de 40 min) n’ont pas pu être obtenues par cette méthode. De plus, la déformation importante du pic chromatographique associé au DOPAC nous a conduit à l’abandon de cette méthode d’analyse. Le couplage de ce système à la SM ne sera pas envisagé.