Analyse par électrophorèse capillaire (EC)

L’électrophorèse capillaire (EC) est une technique séparative puissante adaptée spécialement à l’analyse des ions ou des molécules ionisables. Les avantages de cette technique sont les hautes efficacités et résolutions des séparations, la rapidité de l’analyse et le faible volume d’échantillon nécessaire pour l’analyse [114].

L’électrophorèse capillaire de zone (CZE) et l’électrophorèse capillaire micellaire (MEKC) sont les deux modes les plus répandus de l’EC. Le principe de la CZE est basé sur la différence de mobilité électrophorétique des analytes et elle est principalement utilisée pour la séparation des ions. Le principe de la MECK est basé sur la différence de partage des analytes entre une phase micellaire et une phase aqueuse, cette technique est utilisée la plupart du temps pour l’analyse des composés non-ioniques.

Pour la séparation des catécholamines, la CEZ peut s’appliquer grâce au fait que ces composés sont chargés dans une gamme importante de pH (voir le pKa dans l’ANNEXE 1)

Références bibliographiques : voir pages 72- 75 66 [115]. La MEKC est aussi utilisée et les micelles sont formées la plupart du temps à l’aide du dodecylsulfate de sodium (SDS) [114,116].

Au début, le seul mode de détection disponible en électrophorèse capillaire était l’UV. Les avancées technologiques permettent maintenant l’utilisation en EC, du fluorimètre, du conductimètre et de la SM. La figure I.29 présente la représentation schématique d’un appareil d’électrophorèse capillaire avec détection UV.

Figure I.29. Représentation schématique d’un appareil d’électrophorèse capillaire avec détection UV

Pour l’analyses des catécholamines en EC, différents modes de détection ont été utilisés: l’UV [115], l’électrochimie (ED) [117,118], la chimiluminescence [119,120], la fluorescence y compris la fluorescence induite par laser (LIF) [121], la conductimétrie (CD) [122] et la SM [123].

EC-UV

Si en chromatographie liquide la longueur d’onde utilisée pour la détection UV des catécholamines est généralement 280 nm, en EC l’absence de solvants organiques dans le tampon électrophorétique permet la détection à 220 nm, zone d’absorption maximale pour les

Références bibliographiques : voir pages 72- 75 67 catécholamines comme on peut le voir sur le spectre UV de DA (figure I.13, paragraphe

IV.2.1.1).

La détection UV présente l’avantage de ne pas nécessiter de réactions de dérivation, mais le désavantage d’être peu sensible par rapport au LIF, ED, CD ou SM.

Des limites de détection de l’ordre du µg.mL^-1 pour les catécholamines et leurs métabolites sont rapportées dans la majorité des publications en EC-UV [116,124,125]. Par exemple Sirén et al .[124] ont obtenu des LODs comprises entre 0,6 et 3 µg.mL^-1.

Une amélioration des LODs a été obtenue par Tseng et al. [126] par modification de

charge de la surface du capillaire en utilisant de fortes concentrations de chlorure de poly(diallyldiméthylammonium) (PDDAC), ce qui entraîne une inversion du flux électroosmotique (EOF). Cela a comme effet un affinement des pics (Figure I.30) et donc une amélioration du rapporte signal/bruit. Dans ces conditions les LOD varient entre 3 ng.mL-1

pour le 5HIAA et 20 ng.mL-1 pour VMA.

Figure I.30. Séparation simultanée des catécholamines, indolamines et metanephrines avec une solution 1,2% PDDAC et inversion d’EOF

Conditions électrophorétiques : longueur totale du capillaire 60 cm (longueur effective 50 cm); tampon : 1.2% PDDAC et 5mM acide formique à pH 4.0; voltage : 15kV; injection hydrodynamique à 20 cm d’hauteur pendant 10 s ; détection UV à 220 nm. (1) VMA; (2) HVA; (3) Trp; (4) 5-HIAA; (5) MN; (6) E ; (7) NMN; (8) 3-MT; (9) 5-HT; (10) DA; (11) HMBA; (12) DHBA; (13) TA; (14) 3-IXS [126].

Temps (min)

Absorbance

(mAU

Références bibliographiques : voir pages 72- 75 68

EC-LIF

Grâce à une sensibilité plus importante que celle de l’UV et un montage plus simple que celui nécessaire pour une détection électrochimique, le LIF est très utilisé pour les catécholamines [72,121,127-129]. Les LODs obtenues avec le LIF sont de quelques ng.mL^-1. Par exemple, Zhou et al. [121] ont obtenu respectivement 4,3 ng.mL^-1, 8,1 ng.mL^-1 et 12,4 ng.mL^-1 pour A, DA et NA.

Les limitations de la détection LIF viennent du fait que pour les catécholamines, une réaction de dérivation avec un agent fluorophore s’impose. Les deux inconvénients majeurs de ce fait sont liés d’une part à la quantité minimale de substrat nécessaire pour la réaction de dérivation (les quantités de catécholamines présentes dans les échantillons sont très faibles) et d’autre part, à la présence de produits secondaires de la réaction («pollution» de l’échantillon). Les solutions envisageables sont une pré-concentration de l’échantillon avant la dérivation et une étape de purification après la dérivation [130].

Les agents de dérivation les plus utilisés sont : le 4 chloro-7 nitro 2,1,3 benzoxadiazole (NBD-Cl) [121,128], le naphtalène-2,3-dicarboxyaldehyde (NDA) [72] et la fluorescin-5-isothiocyanate (FTIC) [129].

Pour s’affranchir de l’étape de dérivation Hsieh et al. [131] ont utilisé un détecteur à

fluorescence native induite par le laser (LINF) pour l’analyse d’un mélange standard de DA, A, S, HVA, VMA, TA (tryptamine), Trp et 5HIAA. Les LODs obtenues pour ces analytes varient beaucoup en fonction de la structure de la molécule et vont de 0,06 ng.mL^-1 pour Trp à 120 ng.mL^-1 pour HVA, mais restent comparables à celles obtenues avec le LIF.

EC-SM

Pour l’EC comme pour la CPL, la SM est un mode de détection sensible et spécifique. La possibilité d’identifier les composés même en présence d’une matrice complexe représente l’avantage majeur que la SM offre par rapport à tous les autres détecteurs disponibles à l’heure actuelle. La figure I.31 représente la comparaison entre un électrophérogramme EC-UV et un EC-SM d’une même urine [132]. On peut voir ainsi la supériorité de la SM qui permet l’identification des composés et rend possible la quantification même en présence d’une matrice complexe.

Références bibliographiques : voir pages 72- 75 69

Figure I.31. Comparaison d’une analyse EC-UV (A) et EC-MS (B) d’un échantillon d’urine

Conditions électrophorétiques : UV: longueur totale du capillaire 77 cm (longueur effective 70 cm); tampon: 50mmol.L^-1 acétate d’ammonium – 40 mmol.L^-1 diisopropylamine à pH 4.0; voltage : 20 kV; injection hydrodynamique 30 s; détection UV à 200 nm

SM: longueur totale du capillaire 80 cm; tampon: acétate d’ammonium 50mmol.L^-1 à pH 4.0; voltage : 20 kV; injection hydrodynamique 30 s; [132]

Même si les LODs restent légèrement supérieures à celles obtenues avec le LIF, l’absence d’étape de dérivation et la spécificité de l’analyse sont à l’avantage de la détection SM. Les LODs typiques pour la SM vont de 50 à 250 ng.mL^-1 [14,123,132-134].

En EC-ESI-SM, à cause des faibles débits de l’électrolyte à l’entrée de la masse un liquide additionnel doit être ajouté pour augmenter le débit. Le plus couramment, c’est un alcool (méthanol, éthanol ou propanol) [133] qui est utilisé. Une alternative plus intéressante est représentée par la miniaturisation de la source (source de type nanospray) compatible avec de faible débit d’effluent, qui évite la dilution de l’échantillon par l’élimination du liquide additionnel [123].

Le désavantage majeur de l’EC-SM par rapport à la CPL-SM vient du fait que les LODs sont plus élevées du fait des petits volumes injectés en EC.

Références bibliographiques : voir pages 72- 75 70