Analyse par chromatographie liquide à polarité de phases inversée

Pour la séparation des catécholamines non dérivées en phase inverse on peut observer deux grandes tendances dans la littérature. D’une part, les séparations sur colonne C18 avec des phases mobiles, pour la plupart, très riches en eau [95] et d’autre part, les séparations sur colonne carbone graphite poreux (PGC) avec des phases mobiles plus riches en modificateur organique [64].

a) L’approche C18

Les systèmes chromatographiques sur colonne C18 associés à la détection électrochimique utilisent des phases mobiles avec des quantités importantes de sels. Les phases mobiles sont composées la plupart du temps d’au moins 95% de solution aqueuse de citrate de sodium et/ou d’acide citrique, et au plus de 5% de MeOH ou ACN. Kumarathasan et Vincent [95] ont utilisé un tel système pour la séparation de : NA, A, DA, DOPA et des isomères de la Tyr, mais la faible rétention de la NA rend quasiment impossible son identification dans un échantillon de plasma.

Des meilleurs résultats en terme de séparation sont obtenus par Machida et al [76] en

utilisant une phase mobile semblable et une colonne C30 (plus apolaire que la C18) (Figure

I.21). Dans ces conditions, une importante rétention est observée pour la NA, ce qui permet son dosage dans le plasma avec des courbes d’étalonnage dans des gammes de concentrations comprises entre 40 et 5000 pg.mL^-1 (r² > 0,996).

Références bibliographiques : voir pages 72- 75 55

Figure I.21. Chromatogrammes: (a) plasma artificiel dopé avec 0,5 ng.mL^-1 de chaque

analyte; (b) blanc de plasma artificiel (c) échantillon de plasma d’un patient

Pour (a) et (c) DHBA (standard interne) ajouté en concentration de 1 ng.mL^-1 [76]

Colonne : Deverosil RP Aqueous-AR-5 (L x Ø 250 x 4,6 mm) Phase mobile : acide citrique 1,05% + EDTA 2Na 0,02% ajusté à pH 2,8 avec NaOH/ ACN (98/2 v/v). Détection électrochimique.

Ce système présenté par Machida et al impliquant l’utilisation de composés non

volatils dans les phases mobiles n’est pas compatible avec un couplage LC – SM. D’autres séparations ont été réalisées à l’aide de phases mobiles composées de MeOH ou ACN et de différents acides volatils: acide acétique [84], acide formique [97] ou acide trifluoroacétique TFA [96] compatibles avec la SM.

Li et al. [83] ont présenté une étude de l’influence de la nature de l’acide dans la phase

mobile sur l’intensité du signal en SM pour DOPA et DA. Les meilleurs résultats sont obtenus en présence d’acide formique et d’acide acétique, tandis que la présence de TFA diminue la réponse (figure I.22). La suppression du signal en présence de TFA peut être causée par la

Références bibliographiques : voir pages 72- 75 56 formation d’une paire d’ions entre les analytes protonés et l’anion carboxylé, mais aussi par la volatilité plus faible et la conductivité plus importante de la phase mobile.

Figure I.22. Influence de la nature de l’acide dans la phase mobile sur le signal en SM [83]

T. Hasegawa et al. [98] proposent pour la séparation d’un mélange de 6

catécholamines et métabolites (NA, A, MN, NMN, DA et DOPA) dans le plasma, un système composé d’une colonne C18 et d’une phase mobile constituée d’une solution aqueuse à 1% d’acide formique et de MeOH contenant aussi 1% d’acide formique en mode gradient d’élution. Même si la présence de l’acide dans la phase mobile est favorable à l’ionisation des composés lors de leur analyse en SM comme l’ont constatés Li et al. [83], les LODs

rapportées par T. Hasegawa sont plutôt élevées, de l’ordre de 1 mg.L^-1, donc inacceptables dans le cas d’analyse de traces (les concentrations dans le cerveau, d’après la littérature, sont 1000 fois plus faibles [22,32]).

G. B. Martin et al ont publié en 2007 [99] une méthode pour la séparation en 8

minutes de la NA, l’A, la DA, la DOPA, la 5-S-cysteinyldopa et la α-methyldopa sur une colonne C18 avec une phase mobile similaire à celle de Hasegawa, composée de MeOH/H2O et 0,1% d’acide formique en gradient. Grâce à la pré-concentration de l’échantillon sur des cartouches d’extraction sur phase solide (SPE) ils arrivent à obtenir des LODs plus faibles de l’ordre de 0,2 à 1,5 ng.mL^-1.

Un des avantages de la SM est lié au fait qu’il n’y a plus d’exigence de séparation totale de tous les composés. Seuls les composés ayant la même masse molaire doivent être séparés. Pour les composés de masse molaire différente, une quantification reste possible

Références bibliographiques : voir pages 72- 75 57 même s’ils sont coélués, cela permet de réduire les temps d’analyse. Bourcier et al. [82] ont

ainsi réalisé la détection de 23 neurotransmetteurs et métabolites en moins de 15 minutes, sur une colonne C18 avec une phase mobile ACN/acide formique 0,1% en gradient d’élution.

En ce qui concerne notre problématique, ces conditions ne sont pas suffisantes car le manque de sélectivité du détecteur électrochimique impose le besoin d’une séparation de tous les composés.

b) L’approche PGC

Le PGC est un des supports les plus hydrophobes disponibles en chromatographie, il est exclusivement composé de feuillets plans d’atomes de carbone hybridés sp² disposés selon un motif hexagonal. La valence de ces atomes étant complètement satisfaite, la surface du PGC ne dispose pas de groupements fonctionnels et est comparable à une grande molécule polycyclique aromatique.

La rétention sur PGC est la combinaison de plusieurs mécanismes et ferait intervenir différents types d’interaction:

• Des interactions dispersives (forces de London) entre le PGC et l’analyte d’une part et la phase mobile d’autre part ;

• Des interactions hydrophobes (entre la surface du PGC et les noyaux aromatiques des catécholamines);

• Des interactions de charge induite entre un analyte polaire et la surface polarisable du graphite [100].

Pour la rétention des anions, le PGC fait intervenir en plus des interactions électroniques (transfert de charge donneur-accepteur) entre les doublets d’électrons non liants des anions et les zones appauvries en électrons π du PGC.

La rétention est aussi déterminée par la surface de contact entre l’analyte et le graphite ainsi que par la nature et l’orientation des groupements fonctionnels du soluté par rapport à la surface du PGC. La rétention est donc augmentée pour les molécules planes et diminuée pour les molécules très structurées et rigides qui ne peuvent entrer en contact avec le graphite qu’avec une petite partie de leur surface moléculaire.

Grâce à ses propriétés rétentives, le PGC facilite le couplage LC-SM car il permet d’utiliser des phases mobiles avec une plus forte teneur en modificateur organique qu’avec un support de type C18.

Références bibliographiques : voir pages 72- 75 58

Tornkvist et al. [20] ont mis au point une méthode CPL-SM/SM avec ionisation

positive et négative dans une seule analyse. La séparation du mélange standard de 9 catécholamines (DA, NA, A, Tyr, VMA, HVA, DOPA, DOPAC et ortho methyl DOPA) est obtenue sur une colonne capillaire de PGC (LxØ= 15cm x 200 µm). L’élution est réalisée à l’aide d’une phase mobile composée de 60% de MeOH et 40% de tampon formiate d’ammonium 50 mM, à pH 2,9.. Les auteurs ont ainsi pu mettre en évidence la présence de NA, DA et Tyr dans un extrait de substantia nigra (figure I.23). On remarque cependant une importante dérive de la ligne de base entre 10 et 15 minutes (figure I.23), qui pourrait masquer des composés tels que VMA, DOPAC et DOPA ayant des rétentions dans cet intervalle de temps.

Figure I.23. Analyse d’un échantillon de substantia nigra sur une colonne capillaire en PGC en couplage avec la SM [20]

Colonne capillaire PGC (L x Ø= 15cm x 200 µm). Phase mobile : MeOH / tampon formiate d’ammonium pH 2.9, 0,05 M, (60/40 v/v). Débit : 3 µl/min. Détection : SM/SM (ESI positive)

En plus du fait que A et NA ne peuvent pas être séparés dans ces conditions, un autre point faible de la méthode a été mis en évidence par Rinne et al. [101] qui ont observé la

dégradation par oxydation des catécholamines sur le support PGC.