Analyse par chromatographie liquide d’appariement d’ions

Une alternative pour la séparation des ions peu retenus en chromatographie de phases inversée est la chromatographie d’appariement d’ions (IP-RPLC). Les phases stationnaires utilisées pour ce type de chromatographie sont les mêmes que celles utilisées en phase inverse et sont principalement représentées par les silices greffées C18. En général, les phases mobiles sont constituées d’un mélange de modificateur organique et d’une solution aqueuse

Références bibliographiques : voir pages 72- 75 59 contenant un agent d’appariement d’ions [74]. Les agents d’appariement d’ions sont des composés qui ont un groupement ionique (une tête polaire), de charge opposée à celle des composés à séparer, attaché à une chaîne carbonée hydrophobe grâce à laquelle ils interagissent avec les colonnes apolaires.

Il existe plusieurs théories pour expliquer le mécanisme de rétention en chromatographie de paire d’ions, dont les principales sont les suivantes:

- 1^er modèle: le partage: la paire d’ions entre l’analyte chargé et l’agent d’appariement d’ions de charge opposée se forme d’abord dans la phase mobile puis est adsorbée sur la phase stationnaire;

- 2^ème modèle: l’échange d’ions: dans un premiers temps il y a adsorption de l’agent d’appariement d’ions sur la phase stationnaire, qui se comporte par la suite comme un échangeur d’ions;

- 3ème modèle: l’interaction d’ions avec formation d’une double couche électrique à l’interface solide/liquide: l’agent d’appariement d’ions s’adsorbe sur la phase stationnaire et entraîne l’apparition d’une différence de potentiel entre la surface du solide et la solution. Les solutés ionisés se concentrent dans la couche liquide au voisinage de la surface et forme la «couche diffuse», les ions de même signe que l’agent d’appariement d’ions sont repoussés de la couche diffuse, alors que les ions de signe contraire y sont attirés [102].

Pour l’analyse des catécholamines, la chromatographie d’appariement d’ions représente le mode le plus utilisé [26,35,65,86,103]. Dans les conditions de pH acide correspondant à leur domaine de stabilité, les catécholamines sont sous forme chargée positivement (voir les pka des composés dans l’Annexe 1). Les agents de paire d’ions utilisés sont alors des acides forts qui forment la paire d’ions avec le groupement amine positivement chargé au pH de la phase mobile (généralement pH inférieur à 3).

Les anions de type alkylsulfate et alkylsulfonate sont les plus utilisés pour l’analyse des catécholamines. Avec une longueur de chaîne alkyle qui varie entre 6 et 12 atomes de carbone, ils sont rajoutés dans la phase mobile sous forme d’acide [103] ou de sel de sodium [104]. Les agents de paire d’ions les plus utilisés dans cette famille sont les composés avec 8 carbones: l’acide octylsulfonique (OSA) [79,103,105,106], l’octylsulfonate de sodium (OSS) [97,107] et l’octylsulfate de sodium (SOS) [108]. L’utilisation d’agents de paire d’ions à

Références bibliographiques : voir pages 72- 75 60 chaîne plus courte (6 [65] ou 7 [109] atomes de carbone), et plus longues (10 [110] ou 12 [111] atomes de carbone), a aussi été rapportée. Les phases mobiles typiques sont composées de tampons phosphates, avec des pH voisins de 3, en présence d’EDTA et d’un faible pourcentage de modificateur organique (inférieur à 10%). Les séparations sont réalisées sur des colonnes de type C18 associées principalement à une détection électrochimique. Le rôle de l’EDTA est de complexer les impuretés afin d’obtenir une meilleure ligne de base avec la détection électrochimique.

Sur ce principe, Qu et al. [106] ont réalisé dans un extrait de cerveau de poulet, le

dosage de : NA, A, DA, DOPA, S, 5HIAA, HVA, DOPAC, DOE (deoxyépinephrine) en présence d’isoprenaline comme standard interne. Le système chromatographique est constitué d’une colonne BAS Phase II ODS (LxØ 100x3,2 mm) et d’une phase mobile composée d’un mélange d’ACN et d’une solution aqueuse d’acide monochloracétique 0,1 mol.L-1, de SOS 0,65 mmol.L-1 et d’EDTA 0,5 mmol.L-1 (pH ajusté à 3,05 avec NaOH) (2,9/97,1 v/v). Dans ces conditions une séparation des 10 analytes est réalisée en moins de 25 minutes (Figure I.24). Pour cette séparation, deux types de mécanisme sont mis en jeu pour la rétention des analytes. D’une part, un mécanisme de type appariement d’ions pour les composés aminés protonés et d’autre part, un mécanisme classique de type phase inverse pour les composés qui n’ont pas de fonction amine (HVA, DOPAC) et ne sont pas chargés positivement.

Une faible rétention de DOPA, NA et DOPAC est observée, avec coélution en début de chromatogramme avec des composés endogènes provenant de la matrice (pics signalés par les flèches rouges), ce qui rend impossible la quantification précise de ces trois composés.

Références bibliographiques : voir pages 72- 75 61

Figure I. 24. Chromatogramme d’un homogénat de cerveau (area ventralis)

Colonne et precolonne: Bas Phase II ODS L x Ø 100 x 3,2 mm et respectivement L x Ø 15 x 3,2 mm. Phase mobile: 0,1 mol.L^-1 d’acide monochloroacétique, 0,65 mmol.L^-1 SOS et 0,5 mmol.L^-1 EDTA, (pH ajusté à 3,05 avec NaOH 6 mol.L^-1) 97,1% et 2,9% ACN. Détection électrochimique.

(1) L-DOPA; (2) NA; (3) DOPAC;(4) A; (5) HVA; (6) DA; (7) 5-HIAA; (8) DOE; (9) IS; (10) 5-HT [106]

L’utilisation d’un agent de paire d’ions de chaîne carbonée plus longue peut augmenter la rétention pour ces trois composés et les dégager du volume mort, comme le montre Talwar et al [111] qui ont utilisé le dodecylsulphate de sodium (DSS) (figure I.25):

Figure I. 25. Profil chromatographique d’un extrait d’urine

Colonne : Luna C18 (L x Ø = 250 x 4,6 mm); Phase mobile : tampon dihydrogenophosphate de sodium 50 mmol.L^-1, 250 mg.L^-1 EDTA, 500 mg.L^-1 DSS, 200 ml.L^-1 ACN et 100 ml.L^-1 MeOH. pH ajusté à 2,9 avec H3PO4 6 mol.L^-1 ; Détection électrochimique [111]

Références bibliographiques : voir pages 72- 75 62 La séparation proposée peut être satisfaisante mais l’utilisation des alkylsulfonates non volatils rend incompatible la transposition directe au couplage avec la SM. Pour contourner cet inconvénient, Neubecker et al [31] ont utilisé avec succès l’acide heptafluorobutyrique

(HFBA), acide perfluoré volatil, comme agent d’appariement d’ions pour l’analyse de la NA dans les urines du rat avec une détection par SM.

De leur côté, A. T. Wood et al. [96] ont réussi à séparer en moins de 20 minutes un

mélange de 11 composés (NA, A, DA, DOPA, Tyr, Trp, 5 OH Trp, S, octopamine, tyramine, N-acetylsérotonine) sur une colonne C18 (Altech) avec une phase mobile composée d’eau et de méthanol contenant 0,05% de TFA, en mode gradient d’élution (Figure I.26).

Figure I.26. Profil de la séparation d’un mélange standard des 11 composés.

Colonne: Alltima C18 (L x Ø =150 x 4,6 mm.). de 2,5% à 60% MeOH en 15 minutes. Détection : fluorimétrique.

D. Thiebaut et al [86] ont présenté une étude comparative sur les capacités rétentives

de différentes colonnes C18 et la colonne PGC vis-à-vis d’un mélange de neurotransmetteurs (parmi lesquels: NA, DA, A, DOPA, Tyr et S) en appariement d’ions avec détection par SM. Ils ont mis en évidence le fait qu’à concentration égale de TFA dans la phase mobile (26,5 m mol.L^-1), si pour les colonnes C18, le pourcentage de modificateur organique ne doit pas dépasser 5% pour éviter d’éluer la NA dans le volume mort, sur le support PGC un minimum de 10% de solvant organique dans la phase mobile est nécessaire pour l’élution des composés. Ils montrent aussi que le passage de TFA à HFBA sur PGC a comme effet l’augmentation de la rétention de tous les composés et de ce fait une amélioration de la résolution entre les couples A/ NA et DOPA/ S peut être observée (figure I. 27).

Temps (min)

Intens

ité (u

Références bibliographiques : voir pages 72- 75 63

Figure I.27. Variations des facteurs de rétention sur la colonne PGC en fonction du pourcentage de MeOH avec (A) TFA et (B) HFBA comme agent d’appariement d’ions [86]