a- Préparation des échantillons protéiques
Les cellules sont rapidement lavées trois fois avec du PBS à 37°C (Phosphate Buffer Saline), puis lysées avec un « cell scraper » et un tampon d’extraction contenant 1 % Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 1 mM PMSF (Phénylméthylsulfonyl fluoride, Roche Applied Science) et un cocktail d’inhibiteurs de protéase dilué au 1 : 100 (Sigma Aldrich, P8340). Les échantillons sont ensuite placés sous agitation pendant 15 minutes, puis homogénéisés et traités au sonicateur à raison de trois fois dix secondes à 4° C et 40 W. Le stockage des échantillons se fait à -80° C jusqu’à utilisation.
b- Dosage des protéines
La quantité totale de protéine présente dans les échantillons, est dosée à l’aide du kit BioRad Protein Assay (BioRad) qui utilise une réaction colorimétrique basée sur le principe de la méthode de Lowry (Lowry et al., 1951). Une gamme étalon de BSA est établie entre 0 et 100 µg/mL de protéines. Après 30 minutes d’incubation, la densité optique mesurée à 750 nm permet de déterminer à partir de la gamme étalon la concentration en protéine totale de l’échantillon.
c- Electrophorèse des protéines dans un gel d’acrylamide en conditions dénaturantes
Les échantillons sont mélangés (v/v) avec du tampon de charge contenant du glycérol, du SDS, du -mercaptoéthanol, et du bleu de bromophénol. Le glycérol permet d’alourdir les échantillons afin d’optimiser les dépôts dans les puits du gel. Le Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) charge négativement les protéines, le -mercaptoéthanol rompt les ponts disulfures dans les séquences protéiques abolissant de cette manière les structures secondaires et tertiaires. Le bleu de bromophénol permet de suivre le front de migration. La dénaturation des protéines est provoquée par chauffage des échantillons à 95°C pendant 5 minutes. Le volume d’échantillon correspond au volume nécessaire pour déposer 40 µg de protéines dans les puits du gel. Le gel d’acrylamide est constitué d’un « gel de concentration » et d’un « gel de séparation » (Tableau MM3). Après polymérisation, le gel est placé dans une cuve contenant du tampon de migration (Tableau MM2). Un marqueur de taille (See Blue Plus2 Prestained
Standart 1X, Invitrogen) ainsi que les échantillons protéiques sont alors déposés dans les puits. La migration s’effectue pendant 2 heures à 110 V.
Composé Running Buffer 10x
(pH 8,2-8,5 ajusté avec NaOH)
Tampon de migration Tampon de transfert TBS 10x (pH 7,6) TBS-T Glycine 1,92 M - - - Tris Base 0,25 M - - 200 mM Running Buffer 10x - 50 mL 50 mL - SDS 10% - 5 mL 0,5 mL - Eau distillée - 445 mL 400 mL - 449 mL Méthanol - - 50 mL - NaCl - - - 1,5 M TBS 10x - - - - 50 mL Tween 20 - - - - 1 mL BSA - - - - 2% Lait en poudre - - - - 5%
Tableau MM 2: composition des différentes solutions utilisées pour le Western Blot.
Composé Gel de concentration (pour 3 mL à 7%)
Gel de séparation (pour 4 mL à 10%) Acryl/Bis 30% (mL) 0,7 1,33 Tampon HCl 1M pH 8.8 (mL) - 1 Tampon HCl 1M pH 6.8 (mL) 0,6 - Eau stérile (mL) 1,7 1,67 Temed (µL) 1,5 2 APS 10% (µL) 1,5 20
d- Electrotransfert des protéines sur membrane de nitrocellulose
Après séparation des protéines par migration, le gel de polyacrylamide est placé dans un support, sur une membrane de nitrocellulose de 0,22 µm préalablement imbibée de tampon de transfert (Tableau MM2). De chaque côté, sont ajoutées une plaque de mousse et deux feuilles de papier Whatman également imprégnées de tampon de transfert. Le support est alors positionné dans une cuve remplie de tampon de transfert, de telle sorte que le gel soit orienté du côté de la borne négative de la cuve et la membrane du côté de la borne positive. Le transfert s’effectue pendant 1 heure 30 à 30 V.
Figure MM 3 : représentation schématique des différentes étapes de la technique de Western Blot
(www.genscript.com/images/L00204-1.jpg).
e-
Immunodétection des protéines d’intérêtAprès électrotransfert, la membrane de nitrocellulose est rincée sous agitation pendant trois étapes de 5 minutes avec du TBS-T (tableau MM2). Ensuite, elle est incubée pendant 1 heure à température ambiante avec une solution de TBS-T additionnée de 2% de BSA et de
1) Dépôt des échantillons et migration sur gel d’acrylamide Gel d’acrylamide Membrane de nitrocellulose Anticorps primaire Anticorps secondaire Film photographique 2) Transfert sur membrane de nitrocellulose 3) Incubation avec l’anticorps primaire 4) Incubation avec l’anticorps secondaire 5) Révélation par chimioluminescence
5% de lait pour assurer la saturation des sites non spécifiques. Une fois la saturation réalisée, la membrane est découpée en trois parties, chacune correspondant à la zone de détection des protéines d’intérêt en fonction de leur poids moléculaire et en fonction du marqueur de taille. Dans la première partie, la protéine KCNQ1 (75 KDa) est repérée à l’aide d’un anticorps primaire anti-KCNQ1 (utilisé à 1 µg/mL), dans la seconde partie la protéine GAPDH (40 KDa) est détectée à l’aide d’un anticorps primaire anti-GAPDH (utilisée à 1 µg/mL). Dans la troisième partie la protéine KCNE1 (17 KDa) est observable grâce à un anticorps primaire anti-KCNE1 (utilisé à 6 µg/mL). La détection de la GAPDH permet de contrôler la qualité et la quantité des dépôts des échantillons. Les trois parties de la membrane sont incubées dans du TBS-T 2% de BSA avec les différents anticorps durant toute la nuit sous agitation douce à 4 °C. 24 heures après les membranes sont rincées trois fois cinq minutes avec du TBS-T 2% de BSA, puis incubées à température ambiante dans du TBS-T 2% de BSA durant une heure en présence des anticorps secondaires couplés à une enzyme, la péroxydase (un anti-goat dirigé contre l’anti-KCNQ1, un anti-rabbit dirigé contre l’ anti-KCNE1, et un anti-mouse dirigé contre l’anti-GAPDH). Trois nouveaux rinçages de cinq minutes avec du TBS-T 2% de BSA sont alors réalisés. La révélation par chemiluminescence est obtenue grâce au kit ECL (Enhanced Chemiluminescence Amersham). La péroxydase va catalyser une réaction chimique dans laquelle sont produits des photons visualisés à l’aide d’un film photographique qui est ensuite révélé et fixé.
f- Anticorps utilisés pour le Western Blot
Le Tableau MM4 précise l’origine et la dilution des trois anticorps primaires et secondaires spécifiques, choisis lors de l’application du Western Blot.
Protéine d’interet Anticorps primaire Anticorps secondaire
KCNQ1 Goat polyclonal (Santra Cruz
Biotechnology) dilué au 1/200 ème
Donkey anti-goat (Jakson immunoresearch) dilué au 1/2000 ème KCNE1 Rabbit polyclonal (Alomone Labs)
Dilué au 1/200ème
Goat anti-rabbit (Interchim) dilué au 1/3000 ème
GAPDH Mouse monoclonal (Zymed
Laboratories) dilué au 1/1000 ème
Horseradish anti-mouse (Invitrogen) dilué au 1/3000 ème
Tableau MM 4 : anticorps primaires et secondaires utilisés dans la technique de Western Blot pour les