Analyse des protéines

i.

Dosage des protéines

Les protéines sont quantifiées à l’aide du kit DC Protein assay (Biorad) sur plaque 96 puits à 700 nm. Dans une plaque 96 puits (NUNC), 5 µL d’échantillon est placé en présence de 25 µL de solution A (Une solution alcaline de tartrate de cuivre) et 200 µL de solution B (Réactif de Folin dilué). La réaction se

140 fait à température ambiante pendant 15 minutes. L’absorbance est mesurée à 700 nm à l’aide du lecteur de microplaques CLARIOstar (BMG Labtech). La BSA est utilisée en tant que standard protéique pour ce dosage.

ii.

Mesure d’activité enzymatique.

L’activité de la NADH oxydase est mesurée via la réduction du DCPIP à 608 nm. Les réactions se font en plaque 96 puits à température ambiante et sont suivies pendant au moins 1 minute. Les fractions sont diluées de façon à ce qu’elles aient toutes la même concentration protéique. 50 µL d’échantillon membranaire dilué sont placés en présence de 200 µL du mélange réactionnel composé de : Tris HCl 100 mM contenant 5 mM de MgCl2 et 10 mM de CaCl2, 45 mM de NaN3, 0,25 mM de NADH 2 et 12,5 µM de DCPIP. Le blanc est mesuré en l’absence de substrat (NADH) dans le milieu réactionnel. Les mesures cinétiques se font à l’aide d’un spectrophotomètre Clariostar (BMG Labtech) et les données obtenues avec le logiciel Mars (BMG Labtech) sont retraitées avec Excel (Microsoft Office). La pente des cinétiques obtenues est directement reliée à la vitesse de réaction de la NADH oxydase de l’échantillon concerné. Ces tests peuvent aussi se faire en microcuves si la quantité d’échantillon n’est pas limitante, les volumes utilisés sont alors 50 µL d’échantillons et 1 mL de mélange réactionnel, sur le spectrophotomètre SAFAS.

iii.

Analyse du profil protéique des fractions du gradient

L’analyse protéique est effectuée grâce à un SDS-PAGE contenant 12 % d’acrylamide pour le gel de séparation et 5 % d’acrylamide pour le gel de concentration. 5 à 15 µL de chacune des fractions, contenant la même quantité de protéines, additionnées de tampon Laemli (Cf 1X) sont placés dans les puits. Le gel est mis à migrer à 150 V puis révélé avec de l’Instant Blue (Expedeon) suivi de deux lavages à l’eau.

iv.

Western-Blot

Les protéines sont séparées sur gel SDS-PAGE à 12 % d’acrylamide comme décrit précédemment (4. iii.). Le transfert des protéines sur membrane de nitrocellulose se fait en semi-sec dans du tampon de transfert Tris-Glycine 1X contenant 20 % d’éthanol (Biorad). Le transfert se fait à 15 V pendant 10 minutes. Après transfert les membranes sont bloquées avec une solution de Tris Buffer Saline (TBS) 1X contenant 5 % de lait demi-écrémé. Les anticorps primaires (α Msp A (donnés par Marie

141 Renault/équipe Milon, IPBS/CNRS) (lapin), α ATP synthase (poulet) d’Abcam, α Hyt 27 (souris)) sont dilués dans du TBS 1X – 5 % d’albumine de sérum bovin (BSA) et l’incubation membrane – anticorps se fait pendant la nuit à 4 °C en agitation. Après 3 lavages de 10 minutes avec du TBS 1X contenant 0,2 % de tween 20, les anticorps secondaires (α lapin-HRP (chèvre) de Santa Cruz Biotech, α poulet-HRP d’Abcam et α souris-HRP (chèvre) de Biorad) sont dilués dans du TBS 1X – 5 % de BSA et l’incubation membranes – anticorps se fait pendant 1 H à température ambiante. La révélation se fait à l’aide du kit Millipore d’Immonilon Western Chemiluminescence HRP Substrate. La chimioluminescence est détectée à l’aide du Chemidoc Touch Images (Biorad).

v.

Spectrométrie de Masse : analyses Bottom-Up

Les protéines sont ensuite dosées comme décrit précédemment 4. i). Les protéines sont reprises dans du tampon de charge LAEMMLI 5X composé de : 200 mM de Tris HCl 0,5 M pH 6,8, 10 % de SDS, 50 % de glycérol, 0,4 % de bleu de bromophénol et 125 mM de DTT. Avant dépôt sur gel, les échantillons sont alors réduits grâce au DTT présent dans le tampon de charge (Cf 25 mM) à 95 °C pendant 5 min puis alkylés avec de l’iodoacétamide (100 mM) pendant 30 min à l’abri de la lumière. Les échantillons, contenant chacun 25 µg de protéines, sont déposés sur SDS-PAGE et les protéines sont concentrées en une seule bande. Le gel est coloré à l’Instant Blue (Expedeon) pendant 20 minutes, scanné puis découpé. Les morceaux de gel contenant les protéines sont lavés à l’eau une fois, puis plusieurs fois avec un mélange acétonitrile (ACN) /bicarbonate d’ammonium (25 mM) (1 :1) à 37 °C afin d’éliminer le colorant. Les morceaux de gel sont déshydratés avec de l’ACN pendant 15 min à 37 °C. La trypsine (Sequencing Grade Modified Trypsin, V511A, Promega) reprise dans 50 mM de bicarbonate d’ammonium (20 ng/µL) est ajoutée aux échantillons secs avec un ratio final de 1 : 50 (trypsine : protéines). La digestion des protéines se fait sur la nuit à 37 °C. Les peptides sont extraits du gels grâce à deux incubations successives dans de l’acide formique (AF) (10 %) et de l’ACN (1 :1, v/v) de 15 minutes à 37 °C. Les deux fractions sont rassemblées, séchées puis reprises dans 25 µL d’ACN (2 %), TFA (0.05 %).

Volcano plot : comparaison PM et MMCW (publication)

Les analyses NanoLC-MS/MS sont faites en mode positif avec un Ultimate 3000 RSLCnano (Thermo Scientific) couplé à un spectromètre de masse LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific). 5 µL de chaque échantillon sont chargés sur une précolonne C18 (300 µm inner diameter x 5mm) à 20 µL/min d’ACN (2 %), TFA (0.05 %).

142 Après 5 min de dessalage, la pré-colonne est reliée à la colonne analytique (nanocolonne C18 - 75 µm de diamètre x 15 cm) équilibrée avec un mélange 95 :5 de solvant A (5 % ACN, 0.2 % FA) et de solvant B (80 % ACN, 0.2 % FA) respectivement. Les peptides sont élués à l’aide d’un gradient de 5-25 % de solvant B sur 75 min, puis 25-50 % de solvant B sur 40 min avec un débit de 300 nL/min. Le LTQ-Orbitrap Velos opère avec la logiciel XCalibur pour l’acquisition des données. Les spectres MS sont acquis grâce à l’Orbitrap dans un intervalle 300-2000 m/z avec une résolution de 60 000 pour un m/z de 400. Les 20 ions multichargés (2+ et/ou 3+) sont sélectionnés pour une fragmentation CID et les fragments résultants sont analysés dans la trappe à ions linéraire (LTQ). Pour éviter de sélectionner plusieurs fois le même peptide, une exclusion dynamique est ajoutée dans les paramètres afin de ne sélectionner qu’une seule fois le même peptide sur 1 min.

Etude protéomique des différents compartiments bactériens : PM, MMCW, SP et CP

Les analyses NanoLC-MS/MS sont faites en mode positif avec un Ultimate 3000 RSLCnano (Thermo Scientific) couplé à un spectromètre de masse Orbitrap Fusion Tribrid (Thermo Scientific). 5 µL de chaque échantillon sont chargés sur une précolonne C18 (300 µm inner diameter x 5mm) à 20 µL/min d’ACN (2 %), TFA (0,05 %).

Après 5 min de dessalage, la pré-colonne est reliée à la colonne analytique (nanocolonne C18 - 75 µm de diamètre x 15 cm) équilibrée avec un mélange 95 :5 de solvant A (5 % ACN, 0.2 % FA) et de solvant B (80 % ACN, 0.2 % FA) respectivement. Les peptides sont élués à l’aide d’un gradient de 5-25 % de solvant B sur 75 min, puis 25-50 % de solvant B sur 30 min et enfin 50-98 % sur 10 min avec un débit de 300 nL/min. L’Orbitrap Fusion opère avec le logiciel XCalibur pour l’acquisition des données. Les spectres MS sont acquis grâce à l’Orbitrap dans un intervalle 400-2000 m/z avec une résolution de 120 000 pour un m/z de 400. Les ions les plus intenses sont sélectionnés sur une durée de 3 secondes (TopS3) pour une fragmentation HCD et les fragments résultants sont analysés dans la trappe à ions linéaire. Pour éviter de sélectionner plusieurs fois le même peptide, une exclusion dynamique est ajoutée dans les paramètres afin de ne sélectionner qu’une seule fois le même peptide sur 1 min.

vi.

Analyse bioinformatique des données de Spectrométrie de Masse

Les recherches pour l’identification des peptides et protéines sont effectuées à l’aide de Mascot (Mascot server v2.6.0; http://www.matrixscience.com ; contre la banque de données des protéines de

M. smegmatis mc²155). La carbamidométhylation des cystéines est définie comme étant une

modification fixe. L’oxydation des méthionines et l’acétylation en N-ter des protéines sont définies comme étant des modifications variables. Les autres modifications post-traductionnelles ne sont pas

143 prises en compte et deux sites non clivés par la trypsine par peptide sont autorisés. Les tolérances de masses pour les données MS et MS/MS sont fixées à 8 ppm et 20 mmu respectivement. Le logiciel Proline est utilisé pour l’identification et la quantification label-free des protéines de chacun des échantillons (http://proline.profiproteomics.fr/). Les résultats d’identification de Mascot sont importés dans le logiciel Proline. Les résultats de l’identification, validés pour une peptide rank = 1 et un FDR de 1%, pour chaque réplicat biologique sont regroupés et une liste d’inférence des protéines est créée. Différentes méthodes de quantification des protéines sont possibles avec ce logiciel, nous décidons de quantifier les protéines via les médianes des intensités détectées. Cette méthode de quantification permet de minimiser les variances présentes au sein des réplicats.