Analyse des lipides

i.

Extraction des lipides

Les lipides extractibles sont obtenus par trois extractions successives d’un culot bactérien humide par des mélanges CHCl3/CH3OH dans différentes proportions (1 :2, 1 :1 et 2 :1 (v:v)). Pour 1 g de bactéries il faut environ 12 mL de mélange CHCl3/CH3OH par extraction. Chacune des extractions est réalisée sur la nuit à température ambiante. Les phases organiques sont récupérées par filtration, rassemblées puis séchées à l’évaporateur rotatif. Les lipides sont repris dans du CHCl3 et lavés en ajoutant un volume égal de H2O afin d’éliminer les composés hydrophiles. Enfin, la phase CHCl3, qui constitue le mélange de lipides dits « lipides extractibles totaux », est récupérée dans un tube taré, séchée puis pesée. Le filtre est conservé et pesé afin d’évaluer la quantité de résidus délipidés qui serviront à l’analyse des « lipides liés ».

Pour les lipides contenus dans les fractions membranaires une extraction de Bligh et Dyer est effectuée. Les membranes (0,8 V) sont mises en présence de CHCl3/CH3OH (1 V ; 2V) pendant minimum 1 h à température ambiante puis 1 V d’H2O et 1 V de CHCl3 sont ajoutés au mélange précédent. La phase CHCl3 est récupérée puis séchée sous flux d’air.

ii.

Extraction des acides mycoliques

Les fractions appelées « lipides extractibles » ou « résidus délipidés » contenant des acides mycoliques (MA) sont traitées par un mélange de KOH 7 M/2-methoxyethanol en rapport 1/7 (v:v) pendant trois heures à 110°C. De l’acide sulfurique 20 % est ajouté au mélange réactionnel afin d’atteindre un pH de l’ordre de 1 - 2. Les MA sont ensuite extraits trois fois par de l’éther diéthylique puis la phase éthérée est lavée plusieurs fois à l’eau distillée jusqu’à ce que l’eau de lavage ait un pH neutre. La phase éthérée contient les MA.

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iii.

Analyse des acides mycoliques dans les fractions membranaires

Le protocole d’extraction des acides mycoliques est décrit précédemment (ii.). La phase éthérée est séchée et les lipides sont méthylés avec du diazométhane pendant au moins 15 minutes puis amenés à sec. Les lipides sont repris dans du CHCl3 à une concentration finale de 10 mg / mL et sont analysés par spectrométrie de masse (MALDI-TOF) et par chromatographie (HPTLC). Pour le MALDI-TOF 0,5 µg de lipides et 0,5 µL de matrice (acide 2,5-Dihydroxybenzoique (10 mg / mL dilués dans du CHCl3/CH3OH (1:1 ; v :v)) sont déposés et les analyses sont faites en mode réflectron positif. L’intensité du laser varie entre 3000 et 4500 V selon l’échantillon analysé. Pour l’HPTLC, selon l’échantillon, 100 ou 50 µg de lipides sont déposés, la plaque est développée dans du CH2Cl2 et les MAME (Mycolic Acid Methyl Esters) et les FAME (Fatty Acid Methyl Esters) sont révélés par immersion de la plaque dans 10 % de CuSO4 (p/v)dilué dans une solution de H3PO4/CH3OH/H2O (8:5:87 v/v/v) suivi d’un chauffage à 150°C pendant une vingtaine de minutes.

iv.

Quantification des acides mycoliques

Pour quantifier les acides mycoliques (MA) la phase éthérée est concentrée à l’évaporateur rotatif ou sous flux d’air, récupérée dans un tube en verre préalablement taré, puis séchée et pesée. La saponification libère les MA et les acides gras. Pour séparer ces deux espèces après méthylation au diazométhane, une purification sur colonne de florisil est effectuée, pour une bonne séparation des composés il faut compter 70 g de florisil pour 1 g de matériel. Les élutions consistent en un gradient d’éther de pétrole (EP) et d’éther diéthylique. Chaque fraction est récupérée puis pesée. Le pourcentage de MA libres correspond au rapport des masses des fractions contenant les MA, après vérification par CCM, sur la masse totale des bactéries sèches (m résidus délipidés + m LET). Pour quantifier les MA liés, le même protocole que décrit précédemment est utilisé sur la fraction « résidus délipidés ». Le pourcentage de MA liés correspond à la masse des fractions contenant les MA (vérification par CCM) divisée par la masse des bactéries sèches.

v.

High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC)

Pour une quantification relative, les lipides sont analysés par HPTLC. L’appareil est composé de trois éléments : un déposeur automatique (ATS4), une chambre de migration (ADC2) et un scanneur (Scanner3) en mode fluorescence. 100 µg de lipides de chacune des fractions sont déposés sur une plaque pour HPTLC Silica gel 60. Le solvant de migration utilisé couramment durant cette étude est un mélange CHCl3/CH3OH/ H2O (65 :25 :4) et la révélation se fait à l’aide de la primuline qui est excitée à

138 370 nm par une lampe au deutérium. Les données permettant la quantification relative des lipides sont obtenues avec le logiciel Wincats puis retraitées avec excel si besoin.

vi.

Localisation du LAM

Les LAM sont analysés par SDS-PAGE. Le protocole est le même que celui de l’analyse du profil protéique des fractions, sauf le gel de séparation qui est à 15 % d’acrylamide et la révélation qui se fait au nitrate d’argent. Avant l’ajout du tampon de charge et dépôt sur gel, les échantillons sont traités à la trypsine (Promega) (1 % - sur la nuit) puis colorés au nitrate d’argent.

Solution Composition

A 50 % CH3OH – 12 % TCA – 2 % CuCl2 – qsp eau B 10 % CH3CH2OH – 5 % acide acétique – qsp eau

C 40 % CH3CH2OH – 5 % acide acétique – 0.7 % acide périodique – qsp eau D 10 % CH3CH2OH – qsp eau

E 0.1 % AgNO3 – qsp eau F 10 % K2CO3 – qsp eau

G 2 % K2CO3 – 135 µL de formaldéhyde (pour Vf = 100 mL) – qsp eau

Le gel est placé dans la solution A pendant 20 minutes puis rincé pendant 10 minutes avec la solution B. L’oxydation se fait avec la solution C pendant 10 minutes, puis le gel est rincé avec successivement les solutions B, D et de l’eau mQ pendant 10 minutes pour chacun des rinçages. Le gel est placé dans la solution E à l’abri de la lumière (10 minutes) puis rincé à l’eau (10 minutes). Le gel est ensuite plongé dans la solution F (1 minute) puis G jusqu’à coloration. L’arrêt de la coloration se fait avec la solution B pendant 2 minutes.