Analyse du promoteur du Rgnrh in vivo par transgenèse chez la souris

décisive dans l’isolement des régions 5’-régulatrices du Rgnrh, ainsi que dans l’identification des éléments cis et trans-régulateurs impliqués dans l’expression basale et régulée du Rgnrh. Toutefois, il s’est avéré nécessaire de développer une approche complémentaire in vivo, afin de confronter et valider les résultats obtenus in vitro mais également de pallier le manque d’anticorps dirigés contre le RGnRH pour étudier son patron d’expression grâce à l’utilisation de gènes rapporteurs.

2.5.1. Modèles créés par transgenèse additionnelle

La technique de transgenèse additionnelle consiste à injecter un ADN linéaire double brin, le transgène, directement dans un ovocyte fécondé, généralement dans le pronucléus mâle avant qu’il

ne fusionne avec le pronucléus femelle. Dans certains embryons, le transgène est intégré dans le génome hôte, au hasard et souvent en plusieurs copies. Les embryons sont ensuite réimplantés dans une femelle pseudogestante dont la descendance est génotypée. Chaque animal fondateur est sélectionné pour générer une lignée d’animaux se transmettant le transgène de génération en génération.

Cette technique a permis d’initier l’expression de gènes spécifiques in vivo. Concernant le

Rgnrh, des souris transgéniques ont été créées, par intégration d’une construction composée de la

séquence codante d’un gène rapporteur ou d’un oncogène placée sous le contrôle d’une région promotrice du Rgnrh. Le premier modèle créé comporte le gène rapporteur de la luciférase sous le contrôle du promoteur de 1.9 kb du Rgnrh de souris (McCue et al., 1997). Cette construction induit une expression du gène rapporteur spécifiquement dans l’hypophyse, et, dans une moindre mesure, dans le cerveau et les testicules. Cette expression est évaluée par quantification de l’activité luciférase

in toto dans des lysats d’organes. La même équipe a ensuite créé deux modèles similaires avec un

promoteur ovin de 2,7 ou 9,1 kb (Duval et al., 2000). Ces promoteurs induisent également une activité luciférase maximale dans l’hypophyse. De façon surprenante, les mêmes promoteurs ovins ne sont pas actifs dans les lignées gonadotropes αT3-1 et LβT2, soulignant l’importance des approches in

vivo. Dans tous ces modèles, des modulations de l’expression du transgène ont été observées suite à

un traitement des souris par un sérum anti-GnRH. Les cellules gonadotropes étant les seules à exprimer le Rgnrh dans l’hypophyse, ces effets suggèrent indirectement l’expression du transgène dans ce type cellulaire. En outre, un modèle exprimant l’antigène T du virus SV40 sous contrôle du promoteur murin de 1,2 kb induit l’apparition de tumeurs hypophysaires d’origine gonadotrope, en accord avec l’activité cellulaire-spécifique de ce promoteur in vivo (Albarracin et al., 1999). Un autre modèle contenant le promoteur murin muté au site AP-1 a permis de confirmer l’implication de cet élément dans la régulation homologue du Rgnrh par la GnRH in vivo. En revanche, le site AP-1 n’est pas en jeu dans la spécificité de cette expression, qui est correctement détectée uniquement dans l’hypophyse, le cerveau et les gonades (Ellsworth et al., 2003a).

Au laboratoire, un modèle murin (Rgnrh-hPLAP) a été créé en plaçant la séquence codante de l’enzyme hPLAP sous le contrôle du promoteur du Rgnrh de rat de 3,3 (ou 1,1) kb (Granger et al., 2004). Cette enzyme présente notamment l’avantage d’être détectée in situ sur coupes. Dans l’hypophyse adulte, des analyses effectuées par immunohistochimie avec des anticorps dirigés contre la LHβ, la FSHβ et la TSHβ, ainsi que contre l’ACTH et la GH ont permis de localiser l’expression du transgène dans les cellules gonadotropes à l’exclusion des autres types cellulaires testés, confirmant l’expression spécifiquement gonadotrope de ce promoteur in vivo. En outre, le promoteur de 3,3 kb est activé dès E13,5 dans l’hypophyse en développement, constituant ainsi le marqueur le plus précoce du lignage gonadotrope. En outre, des expériences d’immunohistochimie ont permis de colocaliser l’expression du transgène avec l’expression d’ISL1 et LHX3 à E15,5 (Granger et al., 2006). Cette observation suggère que ces facteurs, impliqués dans l’activation du promoteur in vitro, jouent également un rôle dans son activation in vivo, notamment au cours du développement embryonnaire et de la mise en place du lignage gonadotrope. Outre l’analyse de ces mécanismes moléculaires dans

l’hypophyse, ce modèle permet d’étudier finement les autres sites non hypophysaires d’activité du promoteur, grâce à la grande sensibilité de détection de l’activité de l’hPLAP, mais également à sa haute résolution rendant possible sa localisation sub-cellulaire. Ce modèle palie donc partiellement l’absence d’anticorps fiables dirigés contre le RGnRH.

Il est frappant de remarquer que tous les promoteurs utilisés dans ces modèles permettent d’induire l’expression du transgène spécifiquement dans l’hypophyse de souris, bien qu’ils présentent de nombreuses différences dans les mécanismes régulant leur expression. Ceci suggère que la séquence du promoteur est cruciale dans la sélection des facteurs régulant son expression, mais que la plupart voire tous les facteurs nécessaires à l’expression des différents promoteurs seraient présents dans les cellules gonadotropes de souris.

2.5.2. Modèle créé par transgenèse ciblée

Plus récemment, un modèle murin (Rosa26-Yfp x Rgnrh-Cre) exprimant le gène rapporteur codant l’YFP (Yellow Fluorescent Protein) sous contrôle indirect du promoteur du Rgnrh endogène a été créé afin de repérer les cellules gonadotropes dans des cultures hypophysaires pour y effectuer des mesures in vivo (Wen et al., 2008). En raison de l’absence d’amplification du signal telle que celle fournie par une activité enzymatique, le gène rapporteur Yfp n’a pas été placé sous le contrôle direct du promoteur du Rgnrh, considéré comme un promoteur faible. Une approche de double Knock-in a été menée, en plaçant d’une part la séquence codante de la recombinase Cre dans le locus du Rgnrh, et d’autre part la séquence Yfp dans le locus Rosa26, à expression forte constitutive, en ajoutant un élément STOP floxé en amont de la séquence Yfp. Ainsi, dans les cellules exprimant le Rgnrh, la recombinase Cre est produite et excise l’élément STOP, conduisant à la production massive d’YFP. Outre l’avantage de découpler les taux d’expression du Rgnrh et de l’Yfp, cette méthode est basée sur le principe de recombinaison homologue, grâce à laquelle les sites d’insertion sont parfaitement ciblés. Ainsi, une seule copie de chaque transgène est introduite dans le génome. Ce modèle a pu être validé par colocalisation de l’YFP avec les sous-unités LHβ et/ou FSHβ. En outre, l’YFP est détectée dès E12,75 dans l’hypophyse en développement, confirmant le résultat obtenu au laboratoire avec le promoteur de rat. Impliquant le locus du Rgnrh endogène, cette approche n’apporte aucune information sur la délimitation des régions promotrices régulant son expression. En revanche, elle pourrait a priori contribuer à étudier tous les sites d’expression du Rgnrh murin, quelles que soient les régions régulatrices impliquées, puisque la recombinase Cre devrait subir une régulation transcriptionnelle rigoureusement identique à celle du Rgnrh.