Analyse des paramètres de croissance

Au-delà du signal oui/non, il est possible d’obtenir différentes informations sur les microorganismes à partir de la forme des courbes de fluorescence de la résazurine en fonction du temps. Puisque dans la majorité des gouttes positives, le début du signal ressemble à une exponentielle, nous avons décidé de mener une régression par un modèle exponentiel sur chacune des courbes de nos échantillons et d’extraire un temps de division et un temps de latence pour chacune de nos gouttes positives. Cela correspond au demeurant au modèle mathématique classiquement utilisé pour décrire la croissance

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% PS 030919 (N=3) PS 251119 (N=1) TS 130419 (N=2) TS 291019 (N=2) PS 181019 (N=3) PS 160819 (N=6) TS 020120 (N=3) PS 270919 (N=1) PS 151119 (N=1) TB 030920 (N=4) IA 300920 (N=4) PS 271020 (N=3)

Coefficients de variation des concentrations des plus

probables en cellules cultivables - gouttes

Il existe probablement des différences entre espèces microbiennes en termes de vitesse à laquelle une cellule réduit la résazurine. Cependant, dans le cadre d’une croissance exponentielle, on montre faci- lement que ces différences sont équivalentes à du temps de latence. Nous avons donc décidé de né- gliger ce phénomène.

Nous avons déployé la démarche suivante pour analyser nos données :

5.6.1 Protocole d’analyse des courbes

5.6.1.1 Obtention d’un signal de résazurine « net »

La première étape consiste à obtenir un signal de résazurine « net » : la résazurine subit généralement une légère détérioration au cours du temps, probablement causée par de la réduction de la résazurine par le milieu. On choisit donc pour chaque expérience une goutte « de référence » dans laquelle aucun microorganisme n’a poussé, puis on soustrait aux autres gouttes le signal de la goutte de référence. Pour améliorer encore le signal, on soustrait à chaque goutte le signal moyen de ses quatre premiers runs (trajets dans le tube), ce qui fait commencer toutes les courbes presque à zéro.

Voir Figure 5-18 pour une illustration.

5.6.1.2 Sélection des points pour la régression

On fixe un seuil (« seuil de régression ») qui va nous servir à deux choses : à déterminer quelle goutte on garde pour l’analyse et à choisir quels points on utilise pour la régression.

On garde pour l’analyse les gouttes dont le signal a franchi notre seuil pendant plus de trois runs. Cela exclut donc les gouttes dans lesquelles rien n’a poussé, mais aussi certaines rares gouttes dans les- quelles le signal de résazurine baisse quasi-immédiatement après le début de la croissance des mi- croorganismes (revoir Figure 5-3). Nous appellerons par la suite les gouttes que l’on garde pour l’ana- lyse « gouttes positives ».

Figure 5-18 : Signal de la résazurine après soustraction du signal de la goutte de référence, puis du signal des quatre premiers runs de chaque goutte, pour un sol, dilué 1000 fois. Chaque ligne représente une goutte. Constatez qu’on n’observe plus de dérive du signal de base de la réaszurine.

Une fois ces gouttes choisies, on cherche le run de pente maximal pour chaque goutte et on ne garde pour notre régression que les points :

• Dont le signal « net » de résazurine est au-dessus du seuil de régression • Situés avant le run de pente maximale, ou après 15 runs

Le seuil de régression est choisi à la main et varie entre 0,02 et 0,08 unités arbitraires de fluorescence. Voir Figure 5-19.

On constate que sur ces points, les courbes ont presque toutes une allure exponentielle.

5.6.1.3 Régression

Sur Python, on utilise le module scipy.optimize.curve_fit (https://docs.scipy.org/doc/scipy/refe- rence/generated/scipy.optimize.curve_fit.html) qui fait appel à la méthode des moindres carrés pour mener une régression avec le modèle suivant :

𝐹𝑙𝑢𝑜 = 2!"#$%$ + 𝜀

Avec :

• Fluo le signal « net » de la résazurine • t le temps en heure

• lag une variable liée au temps de latence

• a une variable qui représente le temps de division

• 𝜀 une variable qui permet de compenser la variabilité du signal de base entre gouttes

La régression menée avec python détermine les variables lag, a et 𝜀 qui approchent le mieux les points mesurés, en se basant sur la méthode des moindres carrés.

Figure 5-19 : Illustration du traitement mené sur les mêmes courbes que la figure précédente. Les courbes rouges pleines correspondent aux points que l'on garde pour l'analyse. Les traits jaunes correspondent aux résultats de la régression linéaire menée avec la méthode ci-dessous. Les pointillés ne sont pas pris en compte pour la régression.

Les scripts utilisés sont disponibles sur ce lien : https://gitlab.com/Atakalaka/droplet-analyser

5.6.2 Présentation des résultats

Pour chaque courbe qu’on a réussi à approximer avec notre modèle, on enregistre le temps au seuil et la variable a (le temps de division). On peut alors représenter chaque goutte sur un graphique.

Figure 5-20 : Temps au seuil en fonction du temps de division pour chaque goutte positive d’une culture de P ag- glomerans. Résultat d’une expérience représentés (110 gouttes). Environ 50 bactéries par gouttes en début d’incu- bation.

Figure 5-21 : Temps au seuil en fonction du temps de division pour chaque goutte positive du sol IA 300920. Résul- tats de deux expériences représentés. Environ 5 microorganismes par goutte en début d’incubation.

On constate sur les figures ci-dessus que :

• Les cultures pures donnent des points beaucoup plus groupés que des extraits composés d’un mélange d’espèces du sol

• Les sols ont des signatures différentes les unes des autres

A partir de ces résultats, nous avons cherché à grouper les sols entre eux, à calculer un degré de simi- larité entre sols ; en se basant sur la distance entre les points de chaque sol.

Figure 5-22 : Temps au seuil en fonction du temps de division pour chaque goutte positive du sol PS 270919. Résultats de deux expériences représentés. Environ 5 microorganismes par goutte en début d’incubation.

Ces résultats sont plus exploratoires et moins aboutis que le reste de nos travaux, mais ils ouvrent la voie à une méthode de classification des microbiotes des sols qui se baserait sur des paramètres pure- ment phénotypiques et non génotypiques comme aujourd’hui.