Analyse In-situ par Microscopie Raman

L’avantage du couplage de la spectroscopie Raman à la microfluidique est qu’elle permet une analyse in situ des cristaux contenus dans une goutte, et donc de façon non invasive. De plus, le signal récupéré dû au cristal se distingue facilement du signal dû au laser qui traverse la couche de PFA, le solvant (constituant la goutte) et, potentiellement, une fine couche d’huile (entre la goutte et le capillaire).

Pour cela, une fois l’expérience de cristallisation terminée le capillaire est récupéré puis placé sous le microscope Raman (RXN1 Kaiser Figure 41). L’objectif utilisé est un objectif x10, sa focale permet de visualiser la goutte dans toute sa profondeur en zoomant sans toucher le capillaire (ce qui n’est pas le cas de l’objectif x50 dont nous disposons). Afin d’améliorer le signal Raman lors des mesures, un support en aluminium est placé sous le capillaire.

De plus, il est possible de modifier les conditions expérimentales comme le temps d’exposition (en seconde) et le nombre de répétitions. Ces paramètres vont déterminer le temps de mesure qui pourra varier de 2 s à plusieurs minutes. Ces paramètres sont choisis suivant la qualité du spectre souhaité et la taille du cristal. En effet, plus un cristal est petit, plus sa signature en Raman sera faible.

2.5.2.1. Identification d’un cristal dans une goutte.

Comme le laser traverse le capillaire, l’huile et le solvant en plus du cristal, nous devons dans un premier temps repérer les pics correspondant à ces matériaux. Pour cela, les spectres Raman du capillaire, de l’huile et du solvant sont mesurés en utilisant les mêmes paramètres expérimentaux. La Figure 68 montre la superposition des spectres d’un capillaire en PFA, de l’huile GL106, d’une goutte d’acétonitrile et d’un cristal de Gliclazide contenu dans une goutte avec une exposition de 5 fois 5 secondes. On peut remarquer, sur la courbe bleue, que même si les pics les plus intenses sont ceux du PFA et du solvant, un certain nombre de pics sont caractéristiques du cristal de Gliclazide. La Figure 69 compare le spectre d’un cristal de Gliclazide dans une goutte et le spectre obtenu directement sur la poudre. La superposition des pics obtenus confirme bien l’identification des pics dus au cristal dans la goutte.

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Figure 68. Spectre Raman obtenu à différents endroits d’un capillaire de 500 µm contenant des cristaux de Gliclazide dans des gouttes d’acétonitrile (Exposition : 5X5s)

Figure 69. Spectre Raman d’un cristal de Gliclazide dans une goutte d’acétonitrile (en bleu) et de la poudre de Gliclazide (en vert) (Exposition 5X5)

2.5.2.2. Influence des différents paramètres de mesures

Comme nous avons pu le voir, il est possible d’identifier un cristal dans une goutte, in situ, à l’aide d’un microscope Raman. Cependant, le signal correspondant au cristal peut être faible c’est pourquoi nous verrons, ici, sur quels paramètres il est possible de jouer afin de l’améliorer.

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2.5.2.2.1. Diamètre interne des capillaires

Une manière simple d’obtenir de meilleurs spectres est d’utiliser des capillaires dont la couche de PFA est plus mince. C’est le cas des capillaires de 1 mm de diamètre interne qui ont le même diamètre externe que ceux de 500 µm (1/16’’). Ces capillaires permettent donc d’obtenir des spectres où le pic correspondant au PFA est moins intense. Il est à noter que l’utilisation de capillaire de PFA permet, tout de même, d’obtenir des spectres de suffisamment bonne qualité pour l’identification d’une phase (Figure 68 et Figure 69)

Figure 70. Comparaison du spectre d’un capillaire de PFA de 500 µm (Orange) et de 1 mm (Bleu) vide obtenu dans les mêmes conditions expérimentales (Exposition : 5X5s), le focus étant réalisé au centre du capillaire.

2.5.2.2.2. Influence du focus

Un facteur important lors de la mesure est le focus. Comme le montre la Figure 71, plus l’image du cristal est nette optiquement, plus le signal correspondant au Gliclazide (pic entre 620 et 640 cm-1) est intense et celui du PFA faible (pics entre 560 et 620 cm-1). Cependant on peut remarquer que la différence optique entre les focus 4, 5 et 6 n’est pas flagrante alors que ce dernier permet tout de même d’obtenir un signal significativement plus important. C’est pourquoi, si un spectre de bonne qualité est nécessaire, il sera préférable d’effectuer rapidement plusieurs focus pour déterminer lequel permet d’obtenir un signal optimal.

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Figure 71. Spectres Raman d’un cristal de Gliclazide dans une goutte d’acétonitrile acquis à plusieurs focus. À droite, les photos obtenues à l’aide du microscope, le point rouge représentant le faisceau du laser.

2.5.2.3. Protocole de mesure lors d’un criblage

Nous avons vu comment obtenir le spectre Raman d’un cristal dans une microgoutte, comment repérer ses pics caractéristiques et améliorer le signal obtenu. Cependant, lors d’un criblage du polymorphisme, il n’est pas rare de devoir caractériser plusieurs centaines de microgouttes. De plus, les phases obtenues sont potentiellement inconnues et il sera alors nécessaire d’approfondir les résultats obtenus avec de la diffraction des rayons X. Nous allons voir ici comment nous avons optimisé l’étape de caractérisation in situ en Raman pour que le procédé puisse être applicable dans le cas d’un criblage.

Avant tout, il est nécessaire de mesurer le spectre Raman de la poudre de départ afin d’avoir une référence sur laquelle se baser pour la suite des expériences. Puis un spectre de référence des différents solvants, du capillaire et de l’huile utilisés est acquis (par mesure directe ou en utilisant une base de donnée provenant d’expériences précédentes). Une possibilité est aussi de prendre comme référence le spectre d’une goutte de solvant pur générée dans le capillaire qui sera donc la somme des spectres correspondant au capillaire au solvant et à l’huile.

Ensuite, les gouttes peuvent être passées, une par une, sous le microscope Raman, mais inutile d’avoir des spectres bien définis lors de cette première étape. Le but est

114 uniquement d’identifier si différents types de spectres sont obtenus (ce qui pourrait indiquer la présence de phases différentes). Pour cela, des spectres obtenus dans des conditions d’expositions rapides sont suffisants (2x2s). Si des spectres différents de celui obtenu à partir de la poudre de départ sont identifiés, on peut décider d’acquérir un spectre de meilleure qualité sur une des gouttes présentant des différences. La position de cette goutte est repérée sur le capillaire pour éventuellement la récupérer et la passer en diffraction des rayons X.

Ce protocole de criblage en 2 étapes permet de gagner du temps, d’analyser des centaines de gouttes en quelques heures et de repérer les gouttes qui doivent être récupérées pour des analyses plus poussées.