Analyse et dosage des échantillons

Les HAP des matrices eau et sol ont été dosés par GCMS au Laboratoire Micropolluants

Technologie (Thionville, France) selon la norme NF ISO 15302.

Les échantillons de sang, lait et fèces ont été extraits puis dosés par GCMS au LABERCA

(Laboratoire d’Etude des Résidus et Contaminants dans les Aliments, Nantes) comme décrit

ci-dessous.

b- fèces, ration et sang

Les fèces et la ration ont été traitées après broyage et homogénéisation. A 2 g de fèces ou de

ration broyés, ou 10 mL de sang, sont ajoutées 20 µL des étalons internes à 10 ng/mL

(d10-Phé, d10-Pyr, d12-perylène). Après une agitation de 30 min, une centrifugation (1000 g 15

mn) permet la récupération des solvants. Evaporés à sec, les molécules sont dissoutes dans 3

mL de cyclohexane puis appliqués sur une colonne Envi-ChromP préalablement conditionnée

dans les mêmes conditions que ci-dessus. Après élution des composés interférents avec 3 mL

de cyclohexane, les HAP sont décrochés de la colonne par le passage de 12 mL d’acétate

d’éthyle/cyclohexane (50:50, v/v). Les extraits sont alors évaporés sous flux d’azote. Le

résidu est transféré dans un vial d’injection, complémenté par un étalon externe

(d12-chrysene) puis évaporé à sec. Le tout est repris dans 20 µL de toluène pour injection.

Compte tenu de l’excrétion moyenne de 5,8 kg de MS sèche fécale d’une vache en lactation

(Jurjanz et al., 2002), les quantités de HAP excrétées par jour sont obtenues par une

multiplication des concentrations fécales analysées par cette quantité moyenne.

c- lait

A 10 mL de lait sont ajoutés 10 µL des étalons internes à 1 ng/mL (d10-Phé, d10-Pyr,

d12-perylène). 150 µ L de suc d’Helix Pomatia (Biosepra, Villeneuve la Garenne, France;

préparation contenant 25 unités de β-glucuronidase-arylsulfatase/µL) et 100 µL d’acide

acétique glacial sont additionnés de façon à hydrolyser les métabolites conjugués à l’acide

glucuronique et aux sulfates. Des échantillons supplémentés (ajouts) ainsi que des blancs sont

préparés de la même façon. En plus des étalons internes cités ci-dessus, les molécules

recherchées sont additionnées dans les ajouts : Fluo, Phé, Pyr, B[a]P, 2-OH Fluo, 3-OH Phé,

1-OH pyr et 3-OH B[a]P). Au terme de l’incubation de 16 h à 37 °C permettant l’obtention

de métabolites libres (déconjugaison), le lait est agité pendant 30 mn avec 20 mL d’acétate

d’éthyle/cyclohexane (50:50, v/v). Après agitation, la solution est centrifugée à 1000g 15 mn.

Le surnageant constitué des solvants contenant les molécules mères et les métabolites est

évaporé à sec sous flux d’azote. Récupéré avec 3 mL de cyclohexane, les composés sont

purifiés sur une colonne Envi-ChromP (Styrene-divinylbenzene copolymer resin, Envi Chrom

P: 0.5 g) conditionné avec successivement 3 mL d’eau, de méthanol et de cyclohexane. Après

passage de l’échantillon sur la colonne, l’ajout de 3 mL de cyclohexane permet l’élimination

des composés interférents avant l’élution des molécules avec 12 mL d’un mélange d’acétate

d’éthyle/cyclohexane (50:50, v/v). Après évaporation totale, 2 mL de cyclohexane et 2 mL

d’un mélange méthanol/eau (80:20, v/v) sont ajoutés dans le tube et agités 30 sec. Les deux

phases ont ensuite été séparées par centrifugation (1000g, 5 min). La phase méthanol/eau est

lavée avec 2 mL de cyclohexane et centrifugée à nouveau (1000 g, 5 min) ; le surnageant est

ajouté à la première phase de cyclohexane.

Tableau 25 : HAP utilisés pour la contamination du sol

Molécules Nombre de

cycles

Poids moléculaire

(g/mol)

Log K

_ow

Métabolites recherchés

dans le lait

Fluo 3 166 4,18 2-OH Fluo

Phé 3 178 4,46 3-OH Phé

Pyr 4 202 5,32 1-OH Pyr

B[a]P 5 252 6,04 3-OH B[a]P

Tableau 26 : Caractéristiques physiologiques des vaches laitières utilisées

Vaches

laitières

Production laitière

(L)

Matière grasse

(g/L)

Poids

(kg)

Avant l’essai Pendant l’essai Avant l’essai Pendant l’essai

A 6,9 6,6 53,8 52,3 550

B 9,2 9 39,8 41,3 825

C 12,1 11,1 44,3 46,7 610

Tableau 27 : Calendrier des prélèvements au cours de l’essai

Matrices J0 J3 J7 J14 J16 J19 J21 J28

Lait Oui Oui Oui Oui Non Non Oui Oui

Sang Oui Non Non Non Non Non Non Oui

La phase cyclohexane contenant les HAP est évaporée puis saponifiée avec 5 mL de KOH 10

% pendant 1h20 à 90°C pour éliminer la matière grasse. A l’issue de la saponification, 3 mL

d’eau et 5 mL de cyclohexane sont ajoutés au mélange puis centrifugés (1000 g, 5 min). Le

surnageant est évaporé, l’étalon externe (D-12 chrysène) est ajouté. Le mélange est transféré

dans des vials d’injection, évaporé et repris dans 20 µL de toluène. Les fractions méthanol/eau

mises en commun sont évaporées puis lavées avec 4 mL d’un mélange acétate d’éthyle/eau

(50 :50, v/v), vortexées et centrifugées (1000 g, 5 min). Le surnageant est évaporé, complété

d’un étalon externe (1-OH chrysene), transféré dans un vial d’injection et repris dans 20 µL

N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (MSTFA, Fluka, Buchs, Switzerland) pour

dérivation.

d- conditions chromatographiques

Les dosages ont été réalisés par chromatographie gazeuse (Hewlett-Packard 6890, Palo Alto,

CA, USA) couplée à un détecteur de masse (quadrupole HP-5973). L’injecteur split/splitless

est maintenu à 250°C, la durée du mode splitless est de 1,5 min et le volume injecté de 2 µL.

La colonne utilisée pour la séparation des HAP comme des métabolites est une OV-1

(Ohio-Valley) type (30 m x 0.25 mm I.D., film thickness: 0.25 µm). Les paramètres du GC

appliqués sur la colonne sont 110°C (4 min), 10°C min

^-1

jusqu’à 160°C, 5°C min

^-1

jusqu’à

300°C, puis 15°C min

^-1

jusqu’à 300°C (10 min) pour les HAP et leur métabolites. Les extraits

contenant respectivement les HAP et les métabolites issus du lait ont été injectés séparément,

le solvant d’injection étant différent. Toutes les analyses ont été réalisées en mode Impact

Electronique (70 eV) et mode d’acquisition SIM (Single Ion Monitoring). Les limites de

détection des différentes matrices reposent sur un rapport signal/bruit de 3/1.

e- calcul des coefficients de transfert des HAP du sol en métabolites vers le lait

Les coefficients de transfert des HAP du sol en métabolites dans le lait ont été calculés sur les

apports et les excrétions durant 24h. Ils sont considérés comme le rapport de la quantité d’un

métabolite excrété dans le lait sur la quantité de molécule mère associée apportée via le sol.

Ce coefficient a été calculé en fin d’expérimentation, à partir de la 3

^e

semaine, de façon à être

à l’état d’équilibre.

Dans le document Evaluation du risque de transfert des hydrocarbures aromatiques polycycliques du sol vers le lait chez le ruminant laitier (Page 101-105)