Adjonction de l’agent agrégant et acquisition

A l’aide d’une pipette, nous avons introduit l’agent agrégant dans les cuves avant d’indiquer au logiciel l’instant initial de la mesure. Après 5 à 10 minutes de réaction, nous avons mis fin aux mesures et procéder à l’enregistrement du fichier dans l’appareil ainsi qu’à l’impression des résultats.

83 5.4. Enregistrement des données

a. Données des patients

Avant chaque analyse, nous avons introduit, dans l’appareil, quelques informations sur les patients, à savoir leurs identités (noms et prénoms) et leurs numérations plaquettaires.

b. Agents agrégants utilisés

Nous avons également introduit les différentes informations sur les agents agrégats utilisés dans la base de données du thrombo-agrégomètre, à savoir les noms et dilutions des réactifs, de sorte que, lors de l’enregistrement du fichier et de l’impression des résultats, ces informations soient toujours visibles.

84 5.5. Préparation des réactifs

a.ADP

• Principe

Lorsqu’il est ajouté à un PRP, l’ADP se fixe sur les récepteurs P2Y1 et P2Y12 présents à la surface des plaquettes et induit une agrégation en deux phases[56].

• Préparation et stabilité

Nous avons reconstitué chaque flacon de 0,5 mL au moyen de 0,5 mL d’eau distillée, pour obtenir une solution à 200 µM d’ADP. Après avoir bien agité la préparation jusqu’à dissolution complète, nous l’avons laissée se stabiliser à température ambiante pendant 30 minutes en agitant de temps en temps. La même préparation a été bien homogénéisée avant son utilisation [56].

• Protocole

Nous avons placé un agitateur dans une première cuvette réactionnelle contenant 225 µL de PPP avant d’établir le 100% d’agrégation. Dans une seconde cuvette réactionnelle, nous avons pipeté 225 µL de PRP. Après l’avoir laissé incuber à 37°C pendant 2 minutes dans le thrombo-agrégomètre, nous avons établi le 0% d’agrégation avec le PRP. Il ne restait plus qu’à ajouter 25 µL d’ADP directement dans le PRP, de sorte à obtenir un agent agrégant à 20 µM, et laisser se développer le profil d’agrégation pendant 5 à 10 minutes.

b. Collagène

• Principe

Après addition au PRP, le collagène adhère aux plaquettes par l’intermédiaire des récepteurs GPIa/IIa et GPVI. L’agrégation au collagène présente typiquement un temps de latence dépendant de la concentration en collagène, puis un changement de forme des plaquettes visible par une baisse de la transmission lumineuse suivi d’une vague d’agrégation simple[57].

• Préparation et stabilité

Nous avons reconstitué chaque flacon de 0,5 mL au moyen de 0,5 mL d’eau distillée, pour obtenir une solution à 1 mg/mL de collagène. Après avoir bien agité la préparation jusqu’à dissolution complète, nous l’avons laissée se stabiliser à température ambiante pendant 30 minutes en agitant de temps en temps. La même préparation a été bien homogénéisée avant son utilisation [57].

85 • Préparation des dilutions

Pour la recherche des thrombopathies, il est suffisant de travailler à 2 µg/mL final.

Dans les tubes en verre, nous avons préparé le volume nécessaire de dilution de collagène selon le schéma suivant :

Concentration de collagène (µg/mL) 200 40

Collagène (µL) (concentration) 100 (1mg/mL) 100 (200 µg/mL)

Diluant pour collagène (µL) 400 400

Soit concentration finale dans le test (µg/mL) 2

• Protocole

Nous avons placé un agitateur dans une première cuvette réactionnelle contenant 380 µL de PPP avant d’établir le 100% d’agrégation. Dans une seconde cuvette réactionnelle, nous avons pipeté le même volume de PRP. Après l’avoir laissé incuber à 37°C pendant 2 minutes, nous avons établi le 0% d’agrégation avec le PRP. Il ne restait plus qu’à ajouter 20 µL de collagène (40 µg/mL) directement dans le PRP de sorte à obtenir une concentration finale de 2 µg/mL d’agent agrégant et laisser se développer le profil d’agrégation pendant 5 à 10 minutes.

c. Ristocétine

• Principe

La ristocétine induit l’agglutination des plaquettes d’un PRP en présence de FW[58]. • Préparation et stabilité

Nous avons reconstitué chaque flacon de 0,5 mL au moyen de 0,5 mL d’eau distillée, pour obtenir une solution à 15 mg/mL de ristocétine. Après avoir bien agité la préparation jusqu’à dissolution complète, nous l’avons laissée se stabiliser à température ambiante pendant 30 minutes en remuant de temps en temps. La même préparation a été bien homogénéisée avant son utilisation [58].

• Protocole

Nous avons placé un agitateur dans une première cuvette réactionnelle contenant 225 µL de PPP avant d’établir le 100% d’agrégation et dans une seconde cuvette réactionnelle, où nous avons pipeté le même volume de PRP. Après l’avoir laissée incuber à 37°C pendant 2 minutes, nous avons établi le 0 % d’agrégation avec le PRP. Il ne restait plus qu’à ajouter 25 µL de ristocétine (15 mg/mL) directement dans le PRP de sorte à obtenir une concentration

86 finale de 1,5 mg/mL d’agent agrégant et laisser se développer le profil d’agrégation pendant 5 à 10 minutes.

d. Acide arachidonique

• Principe

Après ajout à un PRP, l’acide arachidonique induit l’agglutination la génération de TxA2 et la libération des granules, conduisant à un changement de forme de plaquettes, visualisé par une baisse de la transmission lumineuse puis une simple vague d’agrégation[59].

• Préparation et stabilité

Nous avons reconstitué chaque flacon de 0,5 mL au moyen de 0,5 mL d’eau distillée, pour obtenir une solution à 5 mg/mL (16 mM) d’acide arachidonique. Après avoir bien agité la préparation jusqu’à dissolution complète, nous l’avons laissée se stabiliser à température ambiante pendant 30 minutes en remuant de temps en temps. La même préparation a été bien homogénéisée avant son utilisation et a été conservée bouchée quand elle n’était pas utilisée de sorte à éviter toute oxydation [59].

• Protocole

Nous avons placé un agitateur dans une première cuvette réactionnelle contenant 225 µL de PPP avant d’établir le 100% d’agrégation et dans une seconde cuvette réactionnelle, où nous avons pipeté le même volume de PRP. Après l’avoir laissée incuber à 37°C pendant 2 minutes, nous avons établi le 0 % d’agrégation avec le PRP. Il ne restait plus qu’à ajouter 25 µL d’acide arachidonique directement dans le PRP de sorte à obtenir une concentration finale de 0,5 mg/mL (1,6 mM) d’agent agrégant et laisser se développer le profil d’agrégation pendant 5 à 10 minutes.

NB : dans tous les cas, le logiciel de l’automate a enregistré la vélocité ainsi que le pourcentage d’agrégation après 3 minutes de réaction et son maximum. La courbe obtenue a été validée par rapport à un témoin sain non traité.