Activités enzymatiques antioxydantes - Les systèmes de réponse au stress dépendant du glutathio

Chapitre 3: Les systèmes de réponse au stress dépendant du glutathion et de la

2.3. Activités enzymatiques antioxydantes

Chez la lignée MDA-MB-468, les effets des deux dérivés, 6f et 7h, sur les enzymes antioxydantes de phase I (SOD et GPx) et de phase II (GST) sont représentés sur la Figure 21, la Figure 22 et la Figure 23, respectivement. Les figures montrent que 6f et 7h augmentent sélectivement les activités enzymatiques de la SOD (Figure 21), GPx (Figure 22) et GST et (Figure 23). En fait, 7h a provoqué une légère augmentation des activités des trois enzymes, ce qui n‟était presque pas significatif par rapport au contrôle négatif pour l‟activité SOD. Cependant, le traitement par la molécule 6f a entraîné une augmentation significative des trois activités enzymatiques de la phase I. De même, sur la lignée MCF-7, les deux dérivés de pyridazin-3(2H)-one testés ont pu induire une augmentation significative de l‟activité SOD similaire à celle induite par le contrôle positif. De plus, l‟activité GPx chez la lignée luminale MCF-7 a noté une augmentation significative plus prononcée dans les cellules traitées par les

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molécules 6f et 7h respectivement. Au terme de l‟analyse, la molécule 6f a montré une augmentation significative de l‟activité SOD qui est supérieure chez la lignée MDA-MB-468 par rapport à celle chez la lignée MCF-7. Cependant, la molécule 7h n‟a pas montré une différence significative entre les deux lignées étudiées. De plus, comme nous l‟avons déjà montré sur la Figure 22, les molécules 6f et 7h ont induit une augmentation avec une différence significative entre les deux lignées tumorales traitées.

Figure 21. Activités de la superoxyde dismutase (SOD) dans les cellules des deux lignées tumorales (MDA-MB-468 et MCF-7) après traitement par des dérivés de pyridazin-3 (2H)-one 6f ou 7h, NT (contrôle négatif) et MTX (contrôle positif). Chaque valeur

représente la moyenne de six répétitions issues de deux expériences indépendantes. Les barres représentent l'erreur standard. Les différentes lettres indiquent des différences significatives entre les différents traitements, pour la même lignée tumorale, à p <0,05. Les signes *, † et ‡ indiquent une différence significative entre les deux lignées tumorales mammaires au même traitement à p <0,05, p <0,01 et à p <0,0001, respectivement.

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Figure 22. Activités de la gluthation peroxydase (GPx) dans les cellules des deux lignées tumorales (MDA-MB-468 et MCF-7) après traitement par des dérivés de pyridazin-3 (2H) -one 6f ou 7h, NT (contrôle négatif) et MTX (contrôle positif). Chaque valeur

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Figure 23. Activités de la glutathion S-transférase (GST) dans les cellules des deux lignées tumorales (MDA-MB-468 et MCF-7) après traitement par des dérivés de pyridazin-3 (2H) -one 6f ou 7h, NT (contrôle négatif) et MTX (contrôle positif). Chaque

valeur représente la moyenne de six répétitions issues de deux expériences indépendantes. Les barres représentent l'erreur standard. Les différentes lettres indiquent des différences significatives entre les différents traitements, pour la même lignée tumorale, à p <0,05. Les signes *, † et ‡ indiquent une différence significative entre les deux lignées tumorales mammaires au même traitement à p <0,05, p <0,01 et à p <0,0001, respectivement.

Dans le même ordre d'idées, l'exposition des cellules tumorales MDA-MB-468 à 7h et 6f affectait différemment les activités GR et TrxR. D'une part, les deux dérivés de pyridazin-3 (2H) -one ont diminué l'activité de GR par rapport aux cellules témoins non traitées (Figure 24). Le changement provoqué par la molécule 6f était comparable à une exposition de 48 heures par le MTX. Cependant, après une exposition de 48 heures à 7h, l'activité des GR a augmenté pour atteindre une valeur similaire à celle observée pour la molécule 6f. Toutefois, les cellules MCF-7 traitées par les molécules 6f et 7h ont montré une toute petite augmentation significative par rapport au contrôle négatif. Dès lors, une différence significative surprenante a été observée entre les deux lignées montrant que les molécules 6f et 7h ont induit une augmentation de 10 fois plus supérieure chez la lignée MDA-MB-468. En revanche, la molécule 7h a entraîné une diminution significative de l'activité de TrxR qui a été observée après 48 heures de traitement chez les deux lignées cellulaires traitées. En fait, la molécule 6f a diminué l'activité de TrxR de 73% chez la lignée MDA-MB-468 et de 58%

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chez la lignée MCF-7 après une exposition de 48 heures par rapport aux cellules non traitées (Figure 25). Quant à la molécule 7h, une diminution de 48% a été remarquée chez la ligné luminale MCF-7 avec une différence non significative entre les deux lignées parallèlement.

Figure 24. Activités de la glutathion réductase (GR) dans les cellules des deux lignées tumorales (MDA-MB-468 et MCF-7) après traitement par des dérivés de pyridazin-3 (2H) -one 6f ou 7h, NT (contrôle négatif) et MTX (contrôle positif). Chaque valeur

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Figure 25. Activités de la thioredoxine réductase (TrxR) dans les cellules des deux lignées tumorales (MDA-MB-468 et MCF-7) après traitement par des dérivés de pyridazin-3 (2H) -one 6f ou 7h, NT (contrôle négatif) et MTX (contrôle positif). Chaque

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Figure 26. Activités de l’Isocitrate dehydrogenase (ICDH) dans les cellules des deux lignées tumorales (MDA-MB-468 et MCF-7) après traitement par des dérivés de pyridazin-3 (2H) -one 6f ou 7h, NT (contrôle négatif) et MTX (contrôle positif). Chaque

3. Discussion

Au cours de la dernière décennie, de nombreuses études s‟intéressent à l‟étude biochimique pour comprendre les mécanismes du cancer. Dans cette approche, la compréhension des différences biochimiques entre les cellules cancéreuses et les cellules normales peut être très bénéfique. Les cellules cancéreuses, comparées aux cellules normales, subissent un stress oxydatif intrinsèque plus important en raison d'altérations du métabolisme. En outre, il a été rapporté que les cellules cancéreuses ont un taux élevé de ROS par rapport aux cellules normales. Cette élévation des ROS peut être le résultat d'un métabolisme oxydatif mitochondrial anormal et peut être responsable de l'initiation et de la progression de différents types de cancers tels que les cancers du sein, de la prostate, du poumon et du colon (Khan et

al., 2013 ; Galadari et al., 2017 ; Prasad, Gupta et Tyagi, 2016 ; Tafani et al., 2016).

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tumorales elles-mêmes. En effet, plusieurs études ont mis en évidence l'implication de niveaux élevés de H₂O₂dans l'induction de l'apoptose (Giorgio et al, 2005 ; Khan et al., 2013) et leur faible concentration augmente la prolifération et la migration des cellules de mammifères (Giorgio et al., 2007). Par conséquent la destruction des cellules cancéreuses par le biais de ROS ou d'agents générateurs de stress oxydatif constitue l'une des théories proposées dans le traitement du cancer (Duan et al., 2014 ; Shaw et al., 2011 ; Yang et al., 2011). Dans la présente étude, nous avons montré une augmentation significative de la teneur en H2O2 dans les deux lignées cellulaires exposées à 6f par rapport au contrôle négatif. En effet, cette augmentation était de 7 fois supérieure et de 30 fois supérieure par rapport au contrôle négatif chez la lignée MCF-7 et MDA-MB-468, respectivement. On a observé également une différence significative (p <0.0001) entre les cellules traitées par le dérivé 6f. De plus, la molécule 7h entraînait une augmentation significative chez la lignée Basale (Figure 19). En outre, pas de différence significative entre les deux lignées traitées par la molécule molécule 7h. Ainsi nos résultats rejoingnent les travaux d‟Emil Petit et al. (2009), qui ont suggéré que les espèces réactives de l‟oxygène (ROS) participent à l‟émergence de la tumeur en raison de leur signalisation apoptotique et contribuent au dommage structurel de l‟ADN par l‟inhibition de la croissance cellulaire induite par le biais du H2O₂, dans les cellules cancéreuses MDA-MB-321 (Petit et al., 2009).

La peroxydation lipidique, qui est un autre indicateur du stress oxydatif, a été quantifiée en mesurant la teneur en Malondialdéhyde (MDA) (Figure 20). Les deux molécules testées dans cette étude ont pu induire chez les deux lignées MDA-MB-468 et MCF-7 une augmentation de la teneur en MDA par rapport au contrôle négatif. Cependant, l'effet de la molécule 6f était plus prononcé que celle de 7h. De plus, les cellules MDA-MB-468 traitées au dérivé 6f présentait un taux de MDA supérieur à celui des cellules MCF-7 (p <0.0001). Alors que, les cellules MDA-MB-468 traitées au dérivé 7h présentaientt un taux de MDA inférieur à celui des cellules MCF-7 (p <0.0001).

La superoxyde dismutase est reconnue comme la principale barrière de défense contre les ROS et catalyse la dismutation des radicaux anioniques superoxydes (O2•^-) en peroxyde d‟hydrogène (H2O2) (Bresciani et al., 2015). Le peroxyde d'hydrogène, généré par l'activité de la SOD, est éliminé par sa conversion en H2O dans les réactions ultérieures par CAT et GPx (Wang et al., 2012). La présente étude a démontré que les molécules de pyridazin-3-(2H)-one 6f et 7h augmentent significativement les activités des enzymes antioxydantes de la phase I (SOD, et de la GPx) et de la pahse II (GST) dans les deux lignées cellulaires tumorales

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(Figure 21, 22 et 23). Cette augmentation a atteint son maximum dans les cellules MDA-MB-468 traitées par la molécule 6f. En effet, les deux molécules testées (6f et 7h) affectent différentiellement ces enzymes. La molécule 7h a induit une légère augmentation des activités de la SOD et de la GPx, mais 6f a la capacité d‟augmenter au moins de 4 fois les activités de la SOD, et de la GPx après 48h d‟exposition. Cet accroissement était encore plus élevé par rapport au contrôle positif. L'augmentation des activités enzymatiques antioxydantes est considérée comme une stratégie normale des cellules pour faire face au stress oxydatif causé par les deux dérivés de pyridazin-3(2H)-one testés ici. Cependant, l'impact du stress oxydatif semble être plus prononcé après exposition à la molécule 6f et 7h. Ainsi, la détermination des taux de peroxydation lipidique dans les cellules, mesurée en tant que teneur en MDA, a montré une augmentation profonde de la peroxydation lipidique après exposition cellulaire à 6f. Ce résultat indique que, malgré l'augmentation des activités enzymatiques antioxydantes (SOD, GPx et GST), les dommages oxydatifs étaient plus prononcés que les cellules ne pouvaient s'arrêter. Ceci rejoint les travaux d‟Abadi et al. (2018), qui ont montré une augmentation d‟activités SOD et GPx associé à un taux élevé de la teneur en MDA (Abadi et

al., 2018). Kosar et al. (2016) ont montré que le traitement des cellules MCF-7 avec de la

mélatonine provoquait une dépolarisation de la membrane mitochondriale, conduisant à la production de superoxyde et à la destruction des cellules tumorales (Kosar et al., 2016).

L'augmentation des enzymes de récupération des ROS est connue pour être un mécanisme de protection contre le stress oxydatif. Dans les cellules cancéreuses, la capacité antioxydante intracellulaire et l‟homéostasie redox sont principalement conférée par les systèmes antioxydants, les systèmes dépendant du glutathion et de la thiorédoxine (Hwang et al., 2015 ; Rodriguez et al., 2004). En effet, les enzymes importantes impliquées dans la régulation de l'homéostasie redox, telles que les peroxydases et les thiol-réductases, se limitent au pool de GSH et de thiorédoxine en tant que source d'équivalents réducteurs (Go et Jones, 2013 ; Cai et

al., 2012 ; Prast-Nielsen et al., 2011). En effet, l'augmentation des ROS ou la diminution des

piégeurs de radicaux libres tels que la GSH et la Trx étaient toxiques pour les cellules tumorales (Zhao et al., 2009 ; Khan et al., 2013). Ainsi, pour déterminer la cause probable de l‟augmentation des ROS et la raison pour laquelle les cellules n‟ont pas pu supporter les dommages oxydatifs, en particulier après traitement avec la molécule 6f, l‟effet des deux molécules 6f et 7h sur TrxR et GR ont été évalués.

Les résultats présentés ici ont montré que l'exposition des cellules tumorales MDA-MB-468 et MCF-7 à des molécules de pyridazinones 6f et 7h affectait différemment les activités

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GR et TrxR (Figure 24 et 25). Les données obtenues ont montré que les molécules 6f et 7h diminuaient l'activité TrxR, alors que l'effet sur l'activité GR était différent. D‟une part, chez la lignée MDA-MB-468 les deux molécules ont diminué l'activité de GR par rapport aux cellules témoins non traitées (Figure 24). Cependant, la diminution était plus prononcée dans les cellules MDA-MB-468 traitées avec les molécules 6f et 7h respectivement. En effet, après 48 h d‟exposition, l‟activité des GR diminuait de 18,5% pour la molécule 6f et de 19,5% pour la molécule 7h. D‟autre part, chez la lignée MCF-7 on remarque une légère augmentation de l‟activité GR après traitement par les molécules 6f et 7h et le MTX. En revanche, une diminution significative de l'activité TrxR a été observée pour laquelle la diminution a atteint 73% et 36% après 48 heures de traitement de MDA-MB-468 avec 6f et 7h, respectivement. Cependant, pour les cellules MCF-7, l'activité TrxR a diminué de 48% et de 58% après une exposition de 48 heures aux molécules 7h et 6f, respectivement. Ainsi, 6f semble être un inhibiteur important de TrxR. Des études antérieures ont montré que l'inhibition de la synthèse réduite du GSH et de la thiorédoxine pourrait être utilisée pour sensibiliser les cellules cancéreuses aux agents de chimiothérapie (Li L et al., 2015 ; Scarbrough et al., 2012 ; Weydertet al., 2008). Récemment, Rodman et al. (2016) ont montré que la déplétion (l'épuisement) du GSH et l'inhibition de l'activité TrxR augmentaient les réponses au rayonnement dans les cellules cancéreuses du sein et du pancréas humains. D‟ailleurs, jusqu'à présent, de nombreux inhibiteurs de TrxR ont été mis au point pour le traitement de tumeurs (Rackham et al., 2010 ; Cai et al., 2011). De même, il a été rapporté que l'expression de TrxR est étroitement liée à la résistance des cellules cancéreuses aux agents chimiothérapeutiques, tels que le cisplatine et la doxorubicine. Dans la présente étude, nous avons montré que, 6f et 7h pouvaient inhiber de manière surprenante l'activité de TrxR spécialement. À notre connaissance, il s'agit de la première étude démontrant que les pyridazinones pourraient induire la mort cellulaire dans les cellules cancéreuses en augmentant l'effet sur l'inhibition de TrxR. A partir de nos données expérimentales, on peut suggérer que l‟inhibition de la TrxR pourrait représenter un mécanisme important de la sensibilité des lignées tumorales en inhibant la chimiorésistance reconnue chez les cellules cancéreuses mammaires.

D‟autre part, Narzano et al. (2006) ont montrés que l'inhibition des TrxR peut affecter l'équilibre rédox intracellulaire et donc altérer la perméabilité de la membrane mitochondriale et la libération consécutive des facteurs pro-apoptotiques aboutissant,par conséquent, à l'apoptose des cellules cancéreuses (Narzano et al., 2006), ce qui laisse supposer que nos molécules 6f et 7h peuvent altérer la perméabilité de la membrane mitochondriale en libérant

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des facteurs pro-apoptotiques pour l‟induction de l‟apoptose chez ces lignées cancéreuses mammaires. Par conséquent, ces résultats pourraient suggérer le TrxR comme une cible thérapeutique pour amélioration de l'efficacité thérapeutique des médicaments anticancéreux actuels ou pour la conception des médicaments anticancéreux, à base des dérivés de pyridazinones, contre le cancer du sein triple négatif et ER-Positif.

Les deux systèmes dépendant du glutathion et de la thiorédoxine nécessitent le NADPH, en tant que cofacteur, pour combattre les ROS générés par le stress oxydatif (Gelman et al., 2018). Ainsi, le déficit en contenu de NADPH peut affecter la réponse cellulaire aux ROS. En effet, il a été rapporté que les cellules exposées au stress oxydatif présentaient des taux réduits de NADPH, ce qui pourrait être le résultat d'une activité élevée des systèmes antioxydants dépendants du NADPH (Gelman et al., 2018). Le NADP + -ICDH est l'une des principales enzymes impliquées dans la fourniture du NADPH (Gelman et al., 2018). En effet, il a été rapporté que la surexpression de NADP + -ICDH est responsable d'une résistance élevée au stress oxydatif. Cependant, une expression réduite du NADP + -ICDH conduit à une faible résistance (Moreno-Sánchez et al., 2017). Dans ce travail, l'exposition des cellules tumorales MCF-7 aux molécules des pyridazinones 6f et 7h a entraîné une diminution significative de l'activité ICDH, qui a diminué de 73% et 50% pour les molécules 6f et 7h des cellules MCF-7 après un traitement de 48 h (Figure 26). La diminution de l'activité de l'ICDH peut être responsable de la déplétion du NADPH utilisé pour faire face au stress oxydatif à travers les systèmes dépendant du glutathion et de la thiorédoxine.

L'étude de l'effet des molécules de la famille des pyridazinones 6f ou 7h sur le système antioxydant des deux lignées cellulaires MDA-MB-468 et MCF-7 a montré que la génération de ROS pouvait être utilisée pour lyser les deux lignées cellulaires mammaires. Par conséquent, les résultats présentés dans cette étude suggèrent que les molécules 6f et 7h ont une capacité antitumorale in vitro importante, en partie grâce à l'augmentation des ROS intracellulaires et d‟autre part, en inhibant les enzymes du système antioxydant de la phase I. Ces résultats suggèrent également que l'efficacité des molécules actuelles contre ces deux lignées tumorales mammaires était via l'inhibition des activités enzymatiques GR et TrxR.

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4. Conclusion et perspectives

Parmi les approches nouvellement développées pour la recherche de nouvelles molécules anti-tumorales, nous nous intéressons à celle basée sur l'induction de la cytotoxicité via l'orchestration du stress oxydatif. À notre connaissance, il s'agit de la première étude portant sur les activités spécifiques des enzymes antioxydantes (SOD, GPx, GST, GR, TrxR, et ICDH) sur les lignées cellulaires du sein triple négatif (MDA-MB-468) et du sein inflammatoire (MCF-7) par les molécules de la famille des Pyridazin-3(2H)-one. Compte tenu de toutes les données, deux molécules, 6f et 7h, se sont révélées hautement actives contre les cellules tumorales étudiées via la manipulation de la génération de ROS. Ceci pourrait être un moyen potentiel de tuer les cellules cancéreuses aussi bien du sein triple négatif que celles du sein exprimant les récepteurs hormonaux et d‟une manière efficace.

À partir des résultats de la présente étude, nous suggérons qu‟une diminution de la peroxydation lipidique et une augmentation de la défense antioxydante pourraient offrir un avantage de freinage sélectif des cellules tumorales mammaires humaines. Par conséquent, les résultats présentés pourraient suggérer le TrxR comme une cible thérapeutique pour amélioration de l'efficacité thérapeutique des médicaments anticancéreux actuels ou pour la conception des médicaments anticancéreux apoptotiques, à base des dérivés de pyridazinones, contre le cancer du sein triple négatif et ER-Positif.

Nos résultats montrent que les dérivés des pyridazinones 6f et 7h pourraient améliorer l'efficacité thérapeutique du traitement actuel du TNBC ainsi que celui du cancer inflammatoire hormono-dépendant via l'inhibition de GR et de TrxR.

Il est clair que, si nous arrivons à cerner le problème de la toxicité systémique des produits antitumoraux ainsi que le phénomène de la résistance tumorale aux molécules utilisées en comprenant les mécanismes moléculaires impliqués dans le comportement des cellules cancéreuses, nous pourrions adopter de nouvelles modalités thérapeutiques en utilisant les nouvelles modalités thérapeutiques en utilisant les dérivés de pyridazinones.

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Dans le document ACTIVITE ANTI-TUMORALE IN VITRO DE NOUVELLES MOLECULES DE PYRIDAZIN-3 (2H)-ONE ORCHESTRANT LE STRESS OXYDATIF DANS LE CANCER DU SEIN : ETUDE CELLULAIRE, BIOCHIMIQUE ET MOLECULAIRE. (Page 113-200)