Activité oestrogénique d’effluents de stations d’épuration du Sahel tunisien et

Les molécules à activité oestrogénique sont parmi les principaux perturbateurs endocriniens transférés vers les milieux naturels via les eaux usées. Ils sont susceptibles de provoquer, à des concentrations de l’ordre du ng/l, des altérations de la croissance, du comportement et de la reproduction. Une des sources majeures de ces molécules sont les êtres humains et les animaux qui les excrètent naturellement via leurs urines. Il existe également des xéno-oestrogènes utilisés comme conservateurs dans l’alimentation ou dans les produits de soins corporels comme les parabènes. Le propyl et le butyl-parabène sont des

conservateurs employés dans les produits de soin personnel ou comme additifs alimentaires. Le propylparabène a des propriétés oestrogéniques et anti-androgèniques et il diminue la production de spermatozoïdes chez les rats mâles. Le butylparabène présente une plus forte activité oestrogénique et il a aussi des effets sur les hormones thyroïdiennes; il affecte la mobilité des spermatozoïdes et leur nombre ainsi que le métabolisme des graisses. Toutes ces molécules se retrouvent donc dans les eaux usées urbaines.

L’objectif de ce travail de recherche est d’étudier le devenir de ces xéno-estrogènes, les parabènes, lors du traitement des eaux usées par les stations d’épuration. La distribution des parabènes (eau, boues, MES) et l’activité oestrogénique au niveau de stations d'épuration ont été analysées en combinant des évaluations chimiques et biologiques. La zone d’étude est située sur le littoral tunisien. Ces travaux ont été publiés dans European Journal of Water Quality en 2011 (vol 42 p 91-103).

Dans cette étude, l’activité oestrogénique des échantillons est exprimée en pourcent par rapport à l’activité oestrogénique produite par une concentration de 10-9 M de 17 β-oestradiol (E2). Ici l’EC50 est la concentration pour laquelle la réponse transcriptionnelle du YES atteint 50% de sa valeur par rapport à des concentrations saturantes de 17 β-oestradiol. L’EC50 est exprimée en équivalent oestradiol.

A l’issu de cette étude, il apparait que l’activité oestrogénique mesurée sur les eaux d’entrée et de sortie, des trois stations, est relativement comparable. Elle est comprise entre 20 et 30% de l’activité de l’oestradiol E2 (10^-9 M) en entrée et 40 et 60% en sortie selon les stations. La comparaison de la concentration effective (EC50) de ces échantillons avec celle de la substance de référence (17 β-oestradiol) montre que la charge équivalente en oestradiol avoisine 10^-9 M. Concernant les échantillons de boues, l’activité oestrogénique est plus importante avec des EC50 pouvant atteindre 10-8M. Les matières en suspension ont une activité oestrogénique plus faible.

Pour les trois stations d’épuration les concentrations en parabènes ont été mesurées par HPLC pour les phases dissoutes, les matières en suspension et les boues. Les cinq parabènes analysés sont le méthyl parabène (MeP), l’éthyl parabène (EtP), le propyl parabène (PrP), le butyl parabène (BuP) et le benzyl parabène (BzP). La concentration des parabènes dans les eaux résiduaires varie de 0,2 à 566 µg/l avec comme parabène majoritaire le méthylparabéne (MeP). La concentration en MeP est très élevée dans la station A. Pour les autres stations, la

concentration de ce dernier est autour de 3µg/l. La station A reçoit des effluents provenant de l’industrie textile. Des échantillons de cet effluent ont été analysés et il apparait que la concentration en MeP atteint 400µg/l, ce qui peut expliquer, du moins en partie, les concentrations relevées au niveau de cette station. Le méthylparabéne est retrouvé dans cette station au niveau des matières en suspensions analysées en sortie. Parallèlement, le méthylparabéne, l’éthylparabéne, le propylparabéne, le benzylparabéne et le buthylparabéne ont été mesurés sur les fractions solides (boues et matières en suspension). Les concentrations mesurées sont beaucoup plus élevées que celles retrouvées dans la littérature, jusqu’à 3500 µg/g de matière sèche pour l’éthylparabéne dans les boues activées II.

L’ensemble de ces résultats montre que l’abattement le plus important des parabènes a lieu au niveau des bassins de traitement biologique (bassin d’activation I et II). En effet, les concentrations dans les eaux traitées, à l’exception du méthylparabéne dans la station A, ne dépassent pas 4µg/l. Par contre, l’activité oestrogénique en sortie de STEP est autour de 60%. Dans notre cas, les parabènes n’expliquent pas la majeure partie de l’activité oestrogénique détectée en entrée et en sortie de STEP, la présence d’autres xéno-estrogènes et/ou de leurs produits de dégradation n’est pas à exclure.

Des résultats complémentaires ont montrés que les parabènes, bien que très présents dans les différents compartiments étudiés ne pouvaient pas expliquer la totalité de l’oestrogénicité évaluée par le Yeast Estrogene Screen. Les équivalents œstradiols (EEQ) ont été calculés pour chaque concentration de parabène, déterminée en HPLC, et ces EEQ ont été sommés pour obtenir un équivalent œstradiol calculé (EEQ calculé parabènes) selon la formule suivante :

où Ci est la concentration du parabène i, et FFAi est le potentiel oestrogénique du parabène i établi avec le Yeast Estrogen Screen (Nguyen 2011).

Cette activité oestrogénique, exprimée en équivalent oestradiol (EEQ calculé parabènes), est comparée à l’activité oestrogénique totale évaluée par le YES (EEQ mesuré YES). Les résultats présentés tableau 15 montrent que l’activité oestrogénique due à la présence des parabènes représente moins de 10% de l’activité oestrogénique totale évaluée par le YES. Dans le cas des boues épaissies, leur activité représente un peu plus de 20% de

l’activité totale. Les parabènes, ne sont donc pas les principaux perturbateurs oestrogéniques présents dans ces effluents et d’autres composés non analysés (car non recherchés) contribuent à cette activité oestrogénique évaluée par le bioessais.

Tableau 15 : Activité oestrogénique exprimée en équivalent oestradiol (EEQ) station A

Entrée Sortie Boues de

retour ^Boues activées I ^Boues activées II Boues épaissies EEQ calculé (M) parabènes ^{4,7 E} -12 7,9 E-13 1,2 E-10 1,2 E-10 1,2 E-09 2,2 E-10 EEQ mesuré (M) (bioessais YES) ^{2,0 E} -10 1,8 E-09 2,0 E-09 9,0 E-09 5,0 E-09 1,0 E-09 EEQ calculé/EEQ mesuré en % ^{2,4% 0,04% 6,3% 1,3% 24,6% 22,5%} station B

Entrée Sortie Boues de

retour ^Boues activée ^Boues activée II Boues épaissies EEQ calculé (M) parabènes ^{2,2 E} -12 2,0 E-13 1,3 E-10 1,2 E-10 1,3 E-09 2,3 E-10 EEQ mesuré (M) (bioessais YES) ^{2,5 E} -11 1,8 E-09 2,0 E-09 9,6 E-09 5,3 E-09 1,2 E-09 % EEQ parabènes/EEQt ^{8,88 0,01 6,37 1,20 25,36 19,46} Station C

Entrée Sortie Boues de

retour ^Boues activée ^Boues activée II Boues épaissies EEQ calculé (M) parabènes ^{9,6 E} -12 2,0 E-13 8,3 E-11 2,6 E-11 nd 2,2 E-10 EEQ mesuré (M) (bioessais YES) ^{3,0 E} -10 1,0 E-08 1,3 E-08 2,0 E-08 1,0 E-09 % EEQ parabènes/EEQt ^{3,21 0,002 0,64 0,13 22,27}

Les mesures établies sur la filière eau, démontrent que la biodégradation (traitement biologique) et l’adsorption des parabènes sur la phase particulaire semblent être les processus majoritaires dans l’élimination des parabènes (pas de traitement cible pour les parabènes). Cette hypothèse est renforcée par les taux élevés de parabènes mesurés dans les boues épaissies en fin de traitement. Certains composés ont une affinité pour les boues et pour les matières en suspension, devenant ainsi un réservoir potentiel pour ces composés. En conclusion, cette étude a permis de réaliser un bilan complet sur trois STEP en considérant tous les compartiments, ainsi que l’activité oestrogénique associée. Peu d’études ont effectué ces mesures sur un seul site. Les résultats enrichissent les informations disponibles dans la

littérature concernant la présence de parabènes dans la fraction dissoute et la fraction particulaire et l’impact spécifique de chacune des étapes du traitement, qui restaient peu étudiées jusqu’à présent. Ils confirment d’autres résultats obtenus précédemment sur le rôle des parabènes vis-à-vis de l’activité oestrogénique. Les effluents et les boues contiennent des teneurs en oestrogène très élevées. Ceci souligne l’importance d’approfondir les connaissances sur la dynamique et la biodégradation des xéno-estrogènes de manière générale par les boues activées et leur devenir au cours du traitement des boues d’épuration.

Activité estrogénique et détection

des parabènes dans trois stations

d’épuration du Sahel tunisien

Ibn Hadj Hassine AZIZA¹, Bazin INGRID¹*_{, Um K}HÉMARY¹, Bartegi AGHLEB²et Catherine GONZALEZ¹

1École des Mines d’Alès, Laboratoire de Génie de l’Environnement Industriel et des Risques Industriels et Naturels, 6 avenue de Clavières, 30319 Ales Cedex, France

2

Department of Biology, Faculty of Sciences– King Faisal University, P.O. Box 1759, 31982 Al Hassa, Saudi Arabia

*Auteur de correspondance : Ingrid.Bazin@mines-ales.fr

(Article reçu le 5 mars 2012 ; accepté le 11 mai 2012)

Résumé – La présence dans l’environnement de composés chimiques ayant des propriétés hormono-mimétiques génère des inquiétudes sur leur devenir et leurs effets sur les organismes aquatiques. Parmi leurs nombreux modes d’action, ces substances ont la capacité de se fixer aux récepteurs des hormones stéroïdiennes comme le récepteur des œstrogènes (ER) en mimant l’effet d’hormones naturelles et induisant ainsi une perturbation du fonctionnement normal du système endocrine. Ils sont liés très souvent au changement dans le « sex-ratio » et la réduction du taux de fécondité chez certains vertébrés. Les substances à activité estrogénique peuvent être d’origine naturelle comme l’estra-diol ou les phyto- et myco-estrogènes, mais également d’origine synthétique comme l’éthynylestradiol, les alkylphénols (surfactants), certains pesticides ou des résidus de cosmétiques. Suite à leur utilisa-tion, ils se retrouvent dans les filières de traitement des eaux usées. Parmi ces molécules, les parabènes, conservateurs fréquemment utilisés dans les produits cosmétiques, les crèmes, les produits phar-maceutiques, sont introduits dans l’environnement via les rejets urbains. Du fait de leur activité estrogénique, ils font partie des composés chimiques dont le niveau de concentration dans l’environne-ment està surveiller.

Dans cetteétude, trois stations d’épuration ont été sélectionnées afin d’avoir une vision actuelle sur la présence des substances estrogéniques dans les eaux usées et sur leur élimination. Dans un premier temps, l’activité estrogénique, à l’aide de test in vitro (Yeast été mesurée en entrée, en sortie de station Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103

# ASEES, 2012

DOI:10.1051/wqual/2012002

Disponible en ligne sur :

activités dues à des polluants estrogéniques. La présence de cinq parabènes, les plus utilisés dans l’industrie pharmaceutique et alimentaire (benzylparabène, buthylparabène, ethylparabène, propylparabène and méthylparabène), a été également recherchée au moyen de l’HPLC/DAD. Le test YES a montré que les échantillons de boues ont la plus forte activité estrogénique avec une EC50 (concentra-tion effective médiane) qui varie de 1E−07 M à 1E−09 M EEQ (equiva-lent estradiol). Cette activité est largement suffisante pour induire des perturbations endocriniennes chez les organismes aquatiques. Par ail-leurs, les analyses en HPLC-DAD ont montré la présence des cinq parabènes dans les échantillons prélevés en entrée et en sortie de station. Ces composés sont présents dans l’eau (mg.L−1_{), les mati}ères en suspension (μg.L−1_{) et s}’accumulent dans les boues (mg.g−1_{). C}’est la première étude qui montre la présence de parabènes dans des effluents tunisiens et la possibilité d’associer cette « pollution » à une activité hormonale dans les trois matrices citées au-dessus, spécialement les boues qui sont souvent utilisées dans certaines activités agricoles.

Mots-clés : Station d’épuration, parabènes, YES (yeast estrogen screen), HPLC-DAD

Abstract – Estrogenic activity and parabens occurrence in three Tunisian wastewater treatment plants.The occurrence of chemicals in the environment, with hormonal activity, increases concern about their fate and effects on the aquatic organisms. Among their various mechanism of action, these compounds have the ability to bind steroid hormones receptors like the oestrogen receptor (ER) and mimic natural hormone effects: inducing disruption on the endocrine system function-ing. They are usually related to sex-ratio disequilibrium and decrease of fertility on some vertebrates fertility. Estrogens can be natural hormone like estradiol, phyto and myco-estrogens, or synthetic such as ethyny-lestradiol, alkylphenols (surfactant), some pesticides and cosmetics. After use, those compounds are found in the different sector of waste-water treatment plants. Among those molecules, parabens and preser-vatives usually used on cosmetics, creams, pharmaceutics, are introduced in the environment through urban effluent. Due to their estro-genic activity, levels of those compounds in the environment must be monitored.

In this study, three wastewater treatment plants were chosen to have an actual point of view on the occurrence of estrogens on the urban wastewater and their removal. First of all, estrogenic activity of the influent, effluent samples, and sludge were investigated using in vitro test (Yeast Estrogen Screen, YES) to evaluate variability in the estro-genic activity that can be attributed to estroestro-genic contaminants.

The occurrence of five parabens among most used ones in pharma-ceutical and food corporations (bénzylparabène, buthylparabène, ethylparabène, propylparabène and méthylparabène), were assessed using HPLC/DAD. Sludge showed the highest estrogenic activity with an EC50 (half maximum effective concentration) between 1E−07 M and 1E 92 I.H.H. Aziza et al.: Eur. j. water qual. 42 (2011) 91–103

HPLC-DAD analysis showed the presence of the five investigated para-bens in the influent and effluent samples. Those compounds were detected in water (mg.L⁻¹), suspended matters (μg.L−1_{) and}

accumu-lates in sludge (mg.g⁻¹).

This is the first study reporting the presence of parabens in Tunisian wastewater and the ability to associate this “pollution” to hormonal activity in the three matrices mentioned above, especially the sludge, which is often used in some agricultural activities.

Keywords: Wastewater treatment plants, parabens, estrogens, YES (yeast estrogen screen), HPLC-DAD

1. INTRODUCTION

De nombreusesétudes font état de la présence dans l’environnement aquatique de substances toxiques de classes chimiques et d’origines très diverses. Toutefois au regard des 41 substances prioritaires listées dans la Directive Européenne (DCE), l’émergence de nouveaux types de contaminants comme les parabènes pose problème aux scientifiques et gestionnaires de l’environnement pour établir une évaluation réaliste du risque pour l’environnement. Les parabènes sont des alkyle esters de l’acide p-hydroxybenzoïque, ils sont utilisés comme antimicrobiens contre les moisissures et les levures dans de nombreux produits alimentaires, pharmaceu-tiques et cosmétiques. Les parabènes les plus utilisés sont le méthyl parabène (MeP) suivi par de l’éthyl parabène (EtP), du n-propyle (PpP), du n-butyl (BuP) parabène et du benzyl parabènes (BzP) (Rastogi et al., 1995). L’activité de ces composés est proportionnelleà la longueur de la chaıˆne alkyle. Certains parabènes sont utilisés à des concentrations inférieures à 1 % dans les produits cosmétiques comme les crèmes, les rouges à lèvres, les lotions pour la peau, les shampooings, etc.

Cependant, depuis plusieurs années ces composés sont un sujet médiatique sen-sible suite à une étude montrant leurs implications dans certains cancers (Darbre,

2006). Plusieursétudes ont montré le pouvoir estrogénique des parabènes : le méthyl parabène, l’éthyl parabène, le n-propyle et le n-butyl parabène ont été identifiés comme faiblement estrogéniques par la méthode de dosage des récepteurs d’estrogènes chez le rat. En utilisant la méthode du « Yeast estrogen screen receptor » (YES), leur activité estrogénique est 100 000 à 30 000 fois moins estrogénique que le 17β estradiol (composé de référence) selon la longueur de la chaıˆne alkyle (Routledge et al.,

1998; Bazin et al.,2010). Le benzyl parabène présente l’activité la plus importante, activité qui au cours de certains tests s’est révélée être plus élevée que celle induite par le bisphénol A (Honma et al.,2002). Des résultats similaires ont été démontrés par des tests in vitro (Okubo et al., 2001; Morohoshi et al.,2005). Le n-butyl parabène a montré une activité estrogénique dans des essais utérotrophiques chez le rat (Routledge et al.,1998). Darbre et al. (2003) aégalement rapporté une augmentation de la masse utérine chez la rate induite par une exposition au benzyl parabène.

En ce qui concerne les essais sur organismes aquatiques, le n-propyle induit chez édaka une augmentation du taux de la vitellogénine (VTG) (Inui et al.,

à celle obtenue suite à une injection de 100–300 mg.kg−1_{de VTG (Pedersen et al.,}

2000; Alslev et al., 2005). Plusieurs études ont conclu que l’effet de certains parabènes sur le système endocrinien est similaire à celui induit par les estrogènes endogènes et pourraient affecter le développement ou la maturation sexuelle de nombreuses espèces vivantes (Oishi 2001, 2002a, 2002b; Kang et al., 2002; Lemini et al.,2004; Tavares et al.,2009).

D’un point de vue environnemental, peu d’études ont été menées pour déterminer le niveau de présence et le devenir de ces composés dans les milieux aquatiques. Les parabènes sont potentiellement « relargués » dans le milieu aquatique via les effluents domestiques. Bien que les stations d’épuration permettent un abattement de ces composés (Lee et al., 2005), le méthyl, éthyl, propyl et butyl parabènes ont été détectés dans des effluents à des concentrations de l’ordre du ng.L−1_{(Paxeus,1996;}

Lee et al.,2005; Canosa et al.,2006) ainsi qu’au niveau de certains sols et sédiments (Núñez et al.,2008). L’éthyl parabène a été détecté dans les sédiments fluviaux japonais sur deux sites d’échantillonnage à des concentrations de 3,3 mg.kg−1_{, les quatre autres}

composés étant à la limite de détection (Japan Ministry of Environment,2002). L’objectif de ce travail est d’étudier l’effet oestrogénique, grâce à un outil in vitro (biotest YES), d’effluents de trois stations d’épuration (STEP) tunisiennes recevant différentes eaux résiduaires (eaux usées urbaines et touristiques, rejets d’industries, rejets agricoles). Le niveau de concentration des cinq principaux parabènes (benzyl parabène, buthyl parabène, éthyl parabène, propyl parabène et méthyl parabène) a ensuiteété déterminé par HPLC-DAD dans ces échantillons. Une comparaison entre ces deux types d’information permet d’évaluer l’implication des parabènes dans la toxicité endocrinienne à laquelle les organismes aquatiques de diverses masses d’eaux (rivières ou eaux côtières) peuvent être soumis.

2. MATÉRIEL ET MÉTHODES

2.1. Sites de prélèvement

Leséchantillons ont été collectés au niveau de trois stations d’épuration dont deux d’entre elles présentent des capacités de traitements similaires (Tab. I). Le prélèvement a été fait au mois de mars 2010 en entrée et sortie de chaque station (le prélèvement est fait sur 24 h), et de chaque compartiment des boues (un prélèvement ponctuel est fait au niveau des boues activées I et II, et des boues épaissies).

Ces trois stations notées A, B et C sont localisées sur le littoral tunisien (fig.1) et traitent des eaux résiduaires venant de plusieurs origines :

– Station A : les eaux résiduaires urbaines et industrielles (essentiellement textile), – Station B : les eaux résiduaires urbaines, industrielles et touristiques,

– Station C : les eaux résiduaires urbaines et agricoles.

Deséchantillons d’eaux et de matières en suspension ont été prélevés en entrées, en sortie. Deséchantillons de boues ont été recueillis à différents niveaux de la filière de traitement : boues de retour, boues activées (I et II) et enfin les boues épaissies (sortie de filière).

2.2. Préparation des échantillons 2.2.1. Phase dissoute

À partir de 1,5 L d’eau en entrée de chaque station, les matières en suspension sont séparées par centrifugation. L’eau est ensuite extraite sur phase solide selon la méthode décrite par Pillon et al. (2005). Cette méthode permet de concentrer les échantillons d’eau sur une colonne de C18 (5 g, 20 mL) en mode inverse. La colonne est préalablement conditionnée avec du méthanol et l’élution est faite avec du méthanol puis avec de l’hexane. L’éluat obtenu est ensuite évaporé à 40 °C et le résidu obtenu est dissous dans 2 mL de méthanol.

2.2.2. Phase particulaire (MES-Matières en Suspension) et boues

Tableau I. Paramètres caractérisant les stations étudiées. Table I. Parameters characterizing studied stations.

Type Population Débit (m3

.J⁻¹) DBO5 (kg.J⁻¹) DCO (kg.J⁻¹)

Eau Station A _{148 000 13500 3125 8440}

Station B _{165 000 15500 3350 9040}

Station C _{17 700 1500 600 780}

Fig. 1. Localisation géographique des trois stations d’épuration. Fig. 1. Geographical location of the three wastewater treatment plants.

80 mL) sous agitation pendant 15 min. Après centrifugation (2 min à 3500 rpm), le surnagent est filtré sur GF/C puis séché avec du sulfate de sodium anhydre. Les extraits sont ensuiteévaporés à l’aide d’un évaporateur rotatif à 40 °C puis repris dans 2 mL de méthanol. Les extraits méthanol sont conservés à −20 °C en attente de l’analyse.

2.3. Test de l’activité estrogénique

La Souche de levure recombinante YES (Yeast Estrogen Screen) aété fournie par le Professeur Barceló Damià (Madrid, Espagne) et contient deux plasmides le pVit (contenant dans cet ordre l’élément ERE, le promoteur CYC et le gène rapporteur B-gal) et le pHHE0 (contient l’ADNc pour le récepteur des œstrogènes sous le contrôle du promoteur ADH1) (García-Reyero et al.,2001; Bazin et al.,2010). Le principe du test de l’activité estrogénique se base sur l’expression d’un gène rapporteur LacZ et la mesure de l’activité de ce gène suite à l’activation des récepteurs des estrogènes (activité β-galactosidase). Le test est fait selon le principe décrit par Bazin et al. (2010). Le 17β-estradiol est utilisé comme composé référant. Une analyse par HPLC/ DAD est faite sur leséchantillons du Galaizon de façon à connaıˆtre la présence ou non de molécules connues à activité estrogénique Cet échantillon est considéré