11.4 Activité de FhuA dans les vésicules géantes 117
Figure 11.3 – Spécificité de la fixation de T5 sur les vésicules contenant FhuA. Les vésicules ne sont pas fluorescentes. Seuls les phages sont marqués selon le protocole 15.3.1. Le tam- pon utilisé est le tampon phage et les phages sont concentrés à 109 virus/mL dans la chambre. Gauche : vésicule lipidique EggPC sans FhuA (EggPC, cf protocole 14), visualisée en transmission et en fluorescence. Quelques points fluorescents (des phages marqués) diffusent rapidement en solution. Droite : vésicule lipidique EggPC+FhuA (1% m(FhuA)/m(EggPC), cf protocole 15.5.2), visualisée en transmission et en fluo- rescence. Les points fluorescents (phages) apparaissent fixés à la surface de la vésicule et diffusent sur celle-ci plus lentement qu’en solution.
11.4.1 Fixation spécifique des phages sur les vésicules géantes
Nous avons marqué les phages de manière fluorescente (protocole 15.3) et vérifié leur fixation spécifique sur les vésicules FhuA. Les phages (109 particules par mL) sont mis en présence de vésicules et sont introduits dans la chambre d’observation. A peine 30 secondes sont nécessaires pour voir apparaître de nombreux phages fluorescents diffusant à la surface des vésicules FhuA. En l’absence de FhuA, des phages fluorescents sont discernables en solution, diffusant beaucoup plus rapidement que sur la membrane, mais ils ne se fixent pas sur les vésicules (figure11.3).
11.4.2 Insertion de l’ADN dans des vésicules géantes contenant FhuA
Nous constatons que la fixation des phages sur la membrane s’effectue en moins d’une minute lorsqu’ils sont introduits dans la chambre à la concentration de 109 phages/mL. Si
nous attendons plus longtemps (de quelques minutes à une heure), il est possible de voir des molécules d’ADN fluctuant à l’intérieur des vésicules (figure11.4), signe du transfert de l’ADN à travers la membrane lipidique.5 Il est intéressant de voir que, bien qu’ils fluctuent, les ADNs restent proches de la membrane. On est tenté de penser que le génome reste attaché par ses deux extrémités au phage, de la même manière que ce qui a été observé dans les expériences du chapitre précédent (10.5).
11.4.3 Perte d’activité de FhuA liée à sa reconstitution en GUV
Les résultats évoqués plus haut apparaissent satisfaisants qualitativement, mais il y a un problème quantitatif. En effet, FhuA est présent en très grande quantité dans la membrane, 5. Les ADNs dans la vésicule sont relativement bien marqués, le Yo-Pro-I parvient à passer à travers la
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L’ ”infection“ à travers une membrane lipidique : vers un système in vitro plus réaliste
20 µm
Figure 11.4 – Visualisation par microscopie de fluorescence de l’ADN transféré dans une vésicule géante contenant FhuA (EggPC+FhuA (1% m(FhuA)/m(EggPC)). Droite : photo (pro- jection maximale de fluorescence d’un film de 10 secondes) montrant ≈ 7 ADNs trans- férés et fluctuant à l’intérieur de la vésicule. Le tampon utilisé est le tampon phage + 1µM de Yo-Pro I qui diffuse à travers le vésicule et marque les ADNs éjectés. Les phages sont concentrés à 109virus/mL dans la chambre. La membrane lipidique apparait fluo- rescente car le Yo-Pro a commencé à diffuser dans les phages attachés à la surface de la vésicule qui n’ont pas éjecté leur ADN. Gauche : représentation schématique de la photo de droite.
comme le montre le marquage homogène de la vésicule fluorescente (figure11.2). En compara- ison, les phages qui se fixent sur la membrane sont très peu nombreux. Un calcul approximatif suggère qu’un phage se fixe pour environ 800 molécules de FhuA reconstituées pour les vésicules EggPC6. Ce n’est pas un problème cinétique puisque la fixation des phages sur les vésicules est très rapide (quelques minutes). Une heure d’attente supplémentaire ne montre pas une augmentation significative du nombre de phages fixés.
Certes, on s’attend à ce que FhuA s’oriente de manière équiprobable dans un sens ou dans l’autre dans la membrane, et donc à une perte d’activité d’un facteur 2. Mais comment expliquer un facteur 800 ? Plusieurs hypothèses sont possibles :
– Perte d’activité liée au marquage fluorescent de FhuA
– Perte d’activité liée à la reconstitution de FhuA dans les SUVs – Perte d’activité liée à l’électroformation des GUVs FhuA
Nous avons testé l’activité des molécules de FhuA après leur marquage fluorescent (voir section
15.4) ; si perte d’activité il y a, elle est au maximum d’un facteur 4. La perte d’activité liée à la reconstitution dans les SUVs est, elle aussi, peu probable.7 Le plus probable est que l’activité de FhuA soit perdue pendant l’électroformation des vésicules géantes (protocole 15.5.2). En 6. Le rapport massique de FhuA par rapport aux lipides est de 1%. Or M(FhuA)=80kg/mol et M(lipides)≈0.8kg/mol. En nombre de molécules, il y a donc 10 000 fois plus de lipides que de protéines. Un lipide occupe une surface environ égale à 0.5nm2dans une membrane lipidique. En divisant par 2 pour tenir compte de la double couche, cela signifie qu’il y a une molécule de FhuA pour une surface membranaire de 2500nm2= 2, 5.10−3µm2. Pour une surface d’un micron carré, cela fait 200 molécules de FhuA actives (sens
d’insertion aléatoire). En supposant qu’un phage se fixe sur une molécule de FhuA, il devrait y avoir 200 phages par micron carré. Or nous observons environ 10 phages sur une surface de 40 micromètres carré. Il y a donc une différence d’un facteur 800 (200*40/10) avec l’activité attendue. L’activité est encore inférieure pour les vésicules DPhPC (facteur 3-4 par rapport à EggPC).