4-1- Introduction et généralités : Le génie génétique et la transgenèse sont deux sciences appartenant à la biotechnologie moderne. La première regroupe l’ensemble des outils et des techniques de la biologie moléculaire permettant, de manière contrôlée, l'étude de la modification
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des gènes (isolement, clonage, séquençage, découpage) dans un but de recherche fondamentale ou appliquée. La deuxième est une technique servant à introduire un gène étranger (transgène) dans le génome d'un organisme (hybridation de gênes), en vue d'obtenir un organisme génétiquement modifié pour un usage donné (Faye et al, 2001 ; Kusnadi et al, 1997).
La transgenèse est donc une application du génie génétique. Les OGM sont des produits issus de la biotechnologie moderne, et plus précisément à la fois du génie génétique et de la transgenèse. Ils regroupent :
Les Organismes vivants modifiés (OVM), possédant une combinaison de matériel génétique inédite suite à des processus qui ne se produisent pas naturellement (semences, végétaux, animaux),
et les produits génétiquement modifiés prêts à la consommation qui ne sont plus vivants et qui ne disposent plus de leur capacité à se reproduire (farine de blé génétiquement modifié, par exemple).
Par ailleurs, afin de pouvoir couvrir la demande croissante des protéines thérapeutiques à l’échelle mondiale et qui n’est pas suivie, en parallèle, d’une croissance de même rythme de leur production (Cramer et al, 1999), il ne suffit plus d’utiliser les méthodes technologiques traditionnelles des bactéries ou des levures, puisqu’il y a toujours des limites pour une production à grande échelle de protéines complexes. C’est la moléculture qui offre à l’industrie pharmaceutique des alternatives aux systèmes de production actuels au faible coût (Faye et al,
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2001). Le passage de la recherche en laboratoire aux essais cliniques puis à la production industrielle a été couronné par un contexte industriel favorable suite à la protection de la propriété intellectuelle par des brevets. En effet, le brevetage des inventions biotechnologiques a contribué à l’essor industriel dans ce secteur. Les inventions protégées par les brevets empêchent les tiers de fabriquer, utiliser ou vendre l’invention pendant une durée de 20 ans. Ainsi, l’inventeur est stimulé à innover, car il peut bénéficier du fruit de ses recherches. Les inventions brevetées doivent être nouvelles, impliquer une activité inventive et être susceptibles d’application industrielle. Mais la délivrance d’un brevet peut être refusée par le gouvernement si ce dernier peut induire des risques plus ou moins directs sur la santé humaine ou sur l’environnement. En outre, le brevetage du vivant engendre des problèmes à plusieurs niveaux : monopole des multinationales et problèmes d’éthique sur la nature vivante des inventions biotechnologiques.
En moléculture, l’« usine de production» des protéines recombinantes à grande échelle est la plante qui est disponible et qui ne coûte pas cher, alors que les bioréacteurs nécessaires dans la production « relativement traditionnelle » coûtent cher (économies d'échelle) (Theisen, 1997; Van Der Logt, 1998), et la méthode de multiplication in-vitro qu’ils utilisent nécessite une haute technologie et un investissement élevé (Richter et al, 2000 ; Buch, 1998 ; Goddjin & Pen, 1995).
En agriculture moléculaire aussi, deux groupes de systèmes végétaux sont utilisés : le feuillage et la graine. Chacun d’eux présente des avantages et
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des inconvénients sans convenir à l’expression de toutes les protéines visées.
Les feuilles (tabac, luzerne...) ont un métabolisme actif et complexe qui offre beaucoup de possibilités, mais elles ont aussi une activité protéasique importante qui limite l’accumulation de certaines protéines (Staub et al, 2000).
Les graines (maïs, colza, carthame, soja et riz) présentent l’avantage d’avoir un contenu en eau moins élevé et offrent donc un milieu d’accumulation plus stable. En revanche, elles ne sont pas adaptées à la synthèse de certaines protéines complexes, et la nécessité d’atteindre la floraison peut représenter un danger accru de dispersion du transgène par le pollen (Boothe et al, 1997).
Toutefois, la molécule recombinante doit être extraite et purifiée à partir de l’ensemble des protéines endogènes de l’organisme. Pour chaque système végétal faisant l’objet de développement commercial (feuilles ou graines), l’enjeu de la récupération de la molécule recombinante est au centre même de la rentabilisation du procédé. En effet,
La purification d’une protéine recombinante compte pour plus de 80 % de ses coûts de production. Cette purification est effectuée par des méthodes traditionnelles de chromatographie ou d’électrophorèse. Ce sont les phases initiales d’extraction et de purification qui posent problème dans la plupart des cas, en particulier en raison de la protéolyse rapide qui a lieu dès l’homogénéisation des tissus (Faye et al, 2001).
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Chez certaines le Carthame, par exemple, la protéine recombinante (insuline) est fusionnée à une autre protéine (oléosine), de la graine. Pour séparer l’oléosine de l’insuline, les chercheurs ont mis au point un système simple de centrifugation.
Parmi les protéines thérapeutiques les plus connues, on peut citer l’albumine, protéine sanguine, produite dans la pomme de terre pour le contrôle du volume sanguin (Sijmons et al, 1990) ; l’hémoglobine, substitut sanguin, produit dans les feuilles du tabac (Dieryck et al, 1997)...
Les plantes offrent donc un fort potentiel pour la production en masse de protéines recombinantes d’intérêt thérapeutique (Arakawa et al, 1998). Cependant, sous leur forme brute, elles ne sont pas encore idéales (comme c’est le cas de certaines bactéries) pour la production de ces protéines parce qu’elles produisent des molécules dont la glycosylation n’est pas toujours compatible avec une application thérapeutique chez l’homme. La modification de la capacité de glycosylation des plantes en vue de l’adapter à un usage thérapeutique, fait l’objet de nombreux travaux de recherche et d’inventions géniales et originales (Lerouge et al, 1998 ; Gomord et al, 1997 ; Navazio et al, 1996).
4-2- La machinerie de glycosylation : La cellule végétale est capable de réaliser la glycosylation des protéines, ce qui lui donne un avantage sur les bactéries et les levures. La glycosylation débute dans le réticulum endoplasmique par l’association au polypeptide, en cours de synthèse, d’un oligosaccharide (appelé N-glycane) qui se fixe sur un acide aminé,
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l’asparagine, en un ou plusieurs points de la chaîne protéique. La protéine devient alors une glycoprotéine.
Cet oligosaccharide subit ensuite de nombreuses modifications sous l’action de glycosidases et de glycosyl-transférases. Cet équipement enzymatique, impliqué dans les phases finales de la maturation golgienne des N-glycanes, est spécifique du système cellulaire. Une cellule végétale ne possède donc pas le même équipement enzymatique que la cellule de mammifère par exemple, ce qui explique la différence existant entre les N-glycanes des glycoprotéines de mammifères et ceux des glycoprotéines de plantes (Von Schaewen et al, 1993 ; Strasser et al, 1999 ; Wenderoth I & Von Schaewen, 2000).
Le N-glycane "végétal" possède des xyloses et un fucose (attaché en -3) alors que le N-glycane "mammalien" possède de l’acide sialique. Ces différences structurales sont à l’origine du principal obstacle à l’utilisation thérapeutique des protéines recombinées issues de cellules végétales : elles pourraient induire la production d’anticorps et, à l’extrême, une réponse allergique chez les personnes auxquelles on les administre. Il semble en effet que l’injection d’une glycoprotéine végétale à un mammifère soit toujours suivie de la production d’anticorps dirigés contre les résidus fucose et xylose des N-glycanes.
Afin d’éviter ces problèmes d’immunologie et d’allergie, deux grandes stratégies sont actuellement envisagées : d’une part l’arrêt précoce du processus de glycosylation avant que n’apparaissent des traits spécifiques
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aux végétaux (xylose associé au fucose), d’autre part l’"humanisation" de la plante de manière à lui faire produire des glycanes de type mammalien.
4-2- 1- En ce qui concerne la première stratégie, il semble que les particularités structurales qui distinguent les glycanes végétaux de leurs homologues mammaliens ne soient introduites que tardivement lors de la maturation de la protéine. On peut donc envisager :
1. De stopper le processus de glycosylation juste avant ces étapes finales qui se déroulent dans l’appareil de Golgi.
2. De maintenir les protéines dans le réticulum endoplasmique. Pour cela, il faut fusionner au transgène une séquence codant pour un peptide (de type HDEL ou KDEL) qui s’insèrerait à l’extrémité C-terminale de la protéine synthétisée et qui provoquerait (par reconnaissance avec un récepteur membranaire du réticulum endoplasmique) le confinement (rétention) de la protéine dans le réticulum endoplasmique.
3. Une autre solution pourrait être de bloquer certaines enzymes-clef de la glycosylation avec des alcaloïdes inhibiteurs de glucosidase tel que la castanospermine.
4. Enfin, on peut envisager de prendre, comme systèmes de production, des plantes déficientes, par suite de mutations, en enzymes responsables de la maturation "végétale" des N-glycanes.
4-2- 2- La seconde stratégie est plus ambitieuse ; il faudrait complémenter l’appareil de Golgi des cellules végétales avec des glycosyl-transférases de mammifère en utilisant les techniques de
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transgenèse. Ce transfert de gène permettrait par exemple d’exprimer une sialyl-transférase (catalysant l’addition d’acide sialique sur le N-glycane) dans l’appareil de Golgi. Cependant, certains problèmes subsistent car il n’est pas évident qu’une enzyme d’origine mammalienne soit active dans une cellule végétale et qu’elle le soit au bon moment et au bon endroit. Toutefois, il a été démontré que des signaux peptidiques permettant l’acheminement et la rétention de glycosyl-transférases dans l’appareil de Golgi d’une cellule de mammifère semblent être les mêmes chez les végétaux. Il suffirait donc de cloner le gène d’origine mammalienne et l’intégrer dans le génome de la cellule végétale pour qu’il soit normalement exprimé dans l’appareil de Golgi.
De nombreuses glycosyl- transférases végétales, et plus particulièrement la β1,2 xylosyl-transférase et l’α 1,3 fucosylt-ransférase, peuvent être clonées et le développement de nouvelles stratégies d’inhibition de ces enzymes, comme la recombinaison homologue, pourrait permettre la production de protéines d’intérêt thérapeutique non immunogènes chez les plantes.
Malgré les problèmes posés par les N-glycanes, la glycosylation reste un processus obligatoire auquel doivent être soumises les protéines recombinées. Elle est responsable du haut degré de conformité existant entre la protéine "sauvage" et la protéine recombinée puisqu’elle apporte à la protéine des modifications d’un point de vue structure, stabilité, activité, solubilité. Cela est particulièrement important pour les protéines destinées à un usage médical. Lorsqu’il s’agit de protéines à usage
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industriel, des différences de composition (par rapport au type "sauvage") et donc une glycolysation imparfaite sont tolérées à condition que les protéines produites possèdent les mêmes caractéristiques fonctionnelles.
4-2- 3- Les «nouvelles» glycosyl-transférases : A côté de ces approches par inactivation des glycosyl-transférases, une autre possibilité prometteuse pour humaniser les N-glycanes végétaux est l’expression de «nouvelles» glycosyl-transférases qui vont compléter et/ou inactiver, par compétition, la machinerie endogène de maturation des N-glycanes de la cellule végétale. Plusieurs glycosyl-transférases de mammifères sont exprimées avec succès dans l’appareil de Golgi de la cellule végétale telle que la GNT I humaine (Von Schaewen et al, 1993) ou l’α(2,6)- sialyltransférase du rat (Wee et al, 1998). Cependant, il a été montré que ces deux glycosyl-transférases recombinantes sont adressées de façon correcte dans l’appareil de Golgi quand elles sont produites dans le système endomembranaire de sécrétion de la cellule végétale. Dans le cadre de ces stratégies de complémentation, plusieurs laboratoires ont émis l’hypothèse selon laquelle l’expression d’une β(1,4)-galactosyl-transférase (GalT) animale dans des compartiments précoces de l’appareil de Golgi végétal pourrait permettre une humanisation partielle des glycanes végétaux et éventuellement prévenir l’association de β(1,2)-xylose et d’α(1,3)-fucose qui a lieu plus tardivement dans l’appareil de Golgi médian et dans le compartiment trans-golgien (Fitchette-Laine et al, 1994).
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En accord avec cette hypothèse, Palacpac et al, 1998, ont montré que la GalT humaine, exprimée dans des cellules de tabac en culture, transfère des résidus galactose sur les résidus N-acétylglucosamine terminaux des N-glycanes végétaux. Plus récemment, une immunoglobuline a été produite dans des plantes de tabac exprimant la GalT humaine. L’expression de cette enzyme humaine dans les plantes de tabac a conduit à la production d’un planticorps dont 30 % des N-glycanes présentent des séquences N-acétyllactosamine terminales identiques à celles associées aux N-glycanes d’anticorps produits dans des cellules de mammifère (Bakker et al, 2001).
D’autres modifications chimiques interviennent également après la synthèse protéique. L’acétylation, qui affecte 80% des protéines et qui correspond au transfert d’un groupe acétyl au groupe aminé N-terminal, semble être un facteur déterminant pour la durée de vie des protéines. L’acylation par un acide gras permet l’insertion de la protéine dans la bicouche lipidique membranaire. La phosphorylation concerne les résidus internes et est une substitution du groupe hydroxyle des sérine, thréonine et tyrosine par un groupe phosphoryle. Cette réaction, facilement réversible, est catalysée par des protéines kinases et des protéines phosphatases. Elle sert à ajuster l’activité de nombreuses protéines.
4-3- Retouches protéolytiques : La protéine synthétisée reste en première étape liée au signal qui a déclanché sa formation ; elle est inactive en cet effet. On dit qu’elle n’est pas mature. Sa maturation nécessite le clivage du polypeptide signal, en présence de protéases
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appropriées (maturation protéolytique). Il est évident et primordial de produire des protéines recombinées dans des cellules végétales ou dans des plantes en général, capables d’assurer une bonne maturation des protéines afin d’obtenir une forme active. L’ingénierie génétique peut parvenir à introduire des séquences responsables de synthèse des enzymes impliquées dans la maturation.
Cette maturation protéolytique est un processus courant d’activation ou d’inactivation des protéines. Pour quelques protéines de sécrétion comme l’hormone de croissance, l’amputation de la séquence signal est la seule scission protéolytique connue : elle transforme d’un coup le polypeptide en la forme active, mature, de la protéine. Pour d’autres protéines, elles sont d’abord synthétisées sous forme de proprotéines, inactives, ce qui leur confère une durée de vie relativement longue. La conversion de la proprotéine en protéine mature s’effectuera généralement dans des vésicules de sécrétion (pour les protéines membranaires et de sécrétion) et consistera en un clivage endoprotéolytique. Lorsque les protéines ne sont pas correctement clivées, il y a une accumulation de protéines inactives dans les cellules, d’où l’importance de cette étape.
4-4- Caractère immunogène des glycanes des « planticorps » (c’est-à-dire anticorps produits chez les plantes) :
L’utilisation en thérapie, chez l’homme ou chez l’animal, de glycoprotéines recombinantes d’origine végétale est encore très limitée. Cabanes- Macheteau M. et al, 1999, a étudié la N-glycosylation d’un
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anticorps monoclonal, Guy’s 13, spécifique d’une adhésine de Streptococcus mutans, une bactérie responsable de la carie dentaire. Il a comparé les caractéristiques de cet anticorps sous deux conditions de production (figure 4) :
Dans un système mammifère (souris), et
Dans des plantes de tabac.
Le chercheur a trouvé les résultats suivants :
Chez le mammifère, l’IgG1 est glycosylée sur deux sites de N-glycosylation par des structures oligosaccharidiques (N-glycanes) qui présentent un résidu α (1,6)-fucose et environ 10% d’acide sialique terminal.
Dans des plantes de tabac, le planticorps Guy’s 13 est également glycosylé sur les mêmes sites de glycosylation, mais les N-glycanes présentent un résidu β(1-2)-xylose associé au résidu l’α(1,3)-fucose.
Lorsque la glycoprotéine d’origine végétale est injectée à certains mammifères et en particulier à l’homme, ce résidu β(1-2)-xylose confère au glycane une forte immunogénicité (Fitchette-Laine et al, 1994). Cela sous-entend une auto- destruction de la protéine chez l’organisme humain et la limite de son utilisation en thérapie chez l’homme (Faye et al, 2001).
Les N-glycanes complexes d’origine végétale participent aussi à l’allergénicité de très nombreux allergènes glycosylés d’origine végétale (Garcia-Casado et al, 1996).
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Figure 4 : Glycosylation de l’anticorps Guy’s 13 (lgG1)
4-5- Humanisation des glycoprotéines recombinantes d’origine végétale : L’« humanisation de la protéine recombinante d’origine végétale » consiste en une modification de la glycosylation afin de produire, dans les plantes, une protéine recombinante « copie conforme » à celle des mammifères (sans résidu immunogène β(1-2)-xylose).
La glycosylation n’est différente entre mammifères et plantes que pendant les dernières étapes de maturation de la protéine. La modification de la machinerie de glycosylation durant sa dernière étape de maturation est donc un moyen utilisé pour humaniser les glycoprotéines recombinantes. De nombreux chercheurs travaillent dans ce domaine, non seulement chez
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les plantes mais aussi chez les levures, dans les cellules de mammifères ou d’insectes utilisées pour la production de protéines recombinantes (Wee et al, 1998; Von Schaewen et al, 1993 ; Tackaberry et al, 1999; Fitchette-Laine et al, 1994). La plupart des stratégies étudiées afin d’humaniser les N-glycanes chez ces différents organismes concernent :
L’inhibition de glycosyl-transférases résidentes de l’appareil de Golgi (pour empêcher le transfert des résidus de sucres immunogènes et leur association avec les résidus spécifiques des protéines recombinantes),
Ou bien l’expression de «nouvelles» glycosyl-transférases dans ce compartiment. (Palacpac et al, 1998).
4-6- Rétention de la protéine recombinante dans le réticulum endoplasmique : Les protéines naturelles résidentes du réticulum endoplasmique portent des glycanes de structure oligo-mannosidique, commune aux plantes (de type β(1,2)-xylosylés et α(1,3)-fucosylés) et aux mammifères (de type α(1,3)-fucosylés), très probablement non immunogènes (Lerouge et al, 1998). Cette caractéristique permettrait d’éviter l’association de glycanes immunogènes (β(1,2)-xylosylés) aux glycoprotéines recombinantes d’origine végétale. La stratégie consiste à stocker la glycoprotéine recombinante dans le réticulum endoplasmique (RE). Ce stockage, présentant l’avantage d’une grande stabilité de la protéine dans la cellule végétale, est possible puisque l’ajout à l’extrémité carboxy-terminale de la protéine recombinante d’un tétrapeptide de séquence KDEL ou HDEL permet sa rétention dans le RE des cellules
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végétales (Gomord et al, 1997). Selon la séquence HDEL ou KDEL, le recyclage de la protéine (du RE vers l’AG puis vers le RE) peut avoir lieu ou bien à un stade tardif (après maturation dans l’AG, c’est-à-dire après glycosylation et attachement de résidus de sucre immunogène β(1,2)-xylosylés) (Von Schaewen et al, 1993) ou bien à un stade précoce, avant l’association β(1,2)-xylosylés et α(1,3)-fucosylés (Fitchette-Laine et al, 1994). Par conséquent, et à cause du résidu β(1,2)-xylosylé, l’expression chez les plantes, d’une glycoprotéine recombinante fusionnée avec une extension HDEL ne peut pas être retenue comme une approche utilisable pour obtenir une glycosylation compatible avec une utilisation thérapeutique chez les mammifères (immunogénicité du résidu β(1,2)-xylosylés). Lorsque les protéines recombinantes sont fusionnées avec la séquence KDEL, leur recyclage est plus efficace, c’est-à-dire beaucoup plus précoce au niveau golgien que lors d’une fusion avec le signal HDEL. C’est seulement dans les compartiments tardifs de l’appareil de Golgi que la maturation des N-glycanes diffère chez les plantes et chez les mammifères, en particulier avec l’ajout de β(1,2)-xylose et d’α(1,3)-fucose à de très nombreux N-glycanes végétaux (Lerouge et al, 1998). C’est ainsi que pour utiliser pleinement l’énorme potentiel du système végétal en vue de produire des protéines à usage thérapeutique, et pour obtenir des N-glycanes humanisés sur les glycoprotéines recombinantes d’origine végétale, il est nécessaire de bloquer les maturations typiques de leur glycosylation.
4-7- Conclusion et perspectives : L’utilisation des plantes pour la production de protéines d’intérêt thérapeutique est donc possible grâce
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aux travaux d’humanisation de la N-glycosylation dans les plantes transgéniques. L’efficacité des stratégies de complémentation visant la production de glycanes non immunogènes dans les cellules végétales a aussi augmenté grâce aux travaux de recherche sur la précision de localisation de la GalT humaine au niveau golgien et sur son niveau d’expression. De tels glycanes présentant des séquences N-acétyllactosamine terminales sont d’excellents supports pour obtenir des copies parfaites des glycanes de mammifères après transfert de l’acide sialique terminal. Ces acides sialiques, absents des N-glycanes de plantes, sont importants, en particulier pour la demi-vie de la majorité des glycoprotéines circulantes de mammifères. L’obtention de N-glycanes sialylés chez les plantes, en adaptant la machinerie de maturation des N-glycanes végétaux, nécessiterait le transfert d’au moins cinq gènes hétérologues différents codant pour des enzymes impliquées dans la biosynthèse de l’acide sialique dans le cytosol et son transport dans l’appareil de Golgi. Les enzymes manquantes de cette voie métabolique devraient non seulement être exprimées de façon stable mais aussi être adressées de façon correcte et enfin être actives dans la cellule végétale. Pour ces différentes raisons, la production de glycoprotéines recombinantes sialylées chez les plantes représente un défi dans le domaine des biotechnologies végétales.
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