5-1- Introduction : Les étapes de synthèse de l’oléosine génétiquement modifiée dans les graines de Carthame ne diffèrent pas de celles de la synthèse des protéines dans la cellule végétale (Fig. 5). Cependant, des manipulations génétiques, souvent compliquées, sont nécessaires afin de conduire à bien la synthèse de la molécule d’intérêt (insuline).
(Commentaire de la figure 5 : La biosynthèse de la majorité des protéines végétales
débute dans le cytosol. Des signaux spécifiques peuvent adresser une partie de cette population protéique vers le noyau, la mitochondrie ou le chloroplaste. La protéine peut présenter un peptide signal ; son élongation s’arrête dans le cytosol pour reprendre une fois transférée vers le réticulum endoplasmique (RE) où les étapes de maturation ont lieu : clivage du peptide signal, glycosylation et formation de ponts disulfures. Les protéines solubles qui présentent à leur extrémité carboxy-terminale des signaux de rétention dans le RE (H/KDEL) vont s’accumuler dans ce compartiment. Une partie de cette population protéique dite résidente du RE échappe au RE et est recyclée vers ce compartiment en passant par l’appareil de Golgi (AG). Les protéines qui ne portent pas de signal de rétention dans le RE seront transportées par l’intermédiaire de vésicules jusqu’à l’AG où ont lieu les principales étapes de la maturation des glycanes. Les protéines qui comportent des signaux de rétention dans l’AG ou la vacuole seront adressées vers leur destination. Celles qui ne comportent pas de signaux seront transférées vers le milieu extacellulaire).
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Figure 5 : Biosynthèse, transport et maturation des protéines Dans la cellule végétale
5-2- Voies d'amélioration de la synthèse des protéines : Afin de pouvoir introduire l’ADN recombinant dans la cellule végétale on utilise un vecteur plasmidien. Cet ADN recombinant est constitué alors d’ADN provenant du vecteur et d’ADN codant pour la protéine recombinée. Un contrôle minutieux doit porter essentiellement sur les points suivants :
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La qualité et la quantité de cet ADN incorporé dans le génome de la plante- hôte sont importantes à considérer afin d’optimaliser le taux de protéine recombinée à produire.
Le gène d’intérêt ne doit pas subir d’inactivation au sein des génomes dans lesquels il a été intégré. En effet, sur la plante Arabidopsis, l’intégration de plusieurs copies d’un gène au même locus augmentent la probabilité que le transgène soit inactivé (Nykiforuk, 2006). Ce phénomène est une cis-inactivation. On parle de trans-inactivation quand, par exemple, deux copies de gène recombiné sont intégrées à des endroits différents dans le génome. Il peut y avoir, dans certains cas une interaction allélique qui débouche sur une inactivation des gènes intégrés. Une corrélation entre l’inactivation des gènes et la méthylation de l’ADN a particulièrement été démontrée pour les transgènes (Buch, 1998 ; Kusnadi et al, 1997).
Souvent la plante réagit, après l’introduction du gène d’intérêt, par ce qu’on appelle « phénomène de co-suppression », généralement dû à une régulation développementale ou à des facteurs environnementaux. Dans la plupart des cas, la co-suppression implique une dégradation post-transcriptionnelle de l’ARN selon différents mécanismes; le plus fréquemment rencontré est celui basé sur la formation de duplex d’ARN qui est l’appariement de deux brins d’ARN complémentaires. Ceux-ci sont synthétisés par deux gènes, un gène codant pour une séquence antisens de la séquence codée par l’autre gène (Barrett & Abergel. 2000).
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Afin d’éviter ces inactivations qui touchent les transgènes, plusieurs solutions peuvent être envisagées :
1. Sélectionner des cellules qui n’ont intégré qu’une seule copie d’ADN recombiné,
2. Développer des méthodes qui permettent d’intégrer une seule copie d’ADN recombiné ou encore sélectionner des cellules végétales avec une activité de méthylation assez faible.
3. Sélectionner des plantes ou cellules qui ont une expression forte et constante de la molécule recombinée.
4. Une solution pratique actuellement utilisée pour faciliter la lecture du gène recombiné consiste à le flanquer de séquences SARs (scaffold associated regions). Ces séquences maintiennent des domaines particuliers de chromosome dans une conformation propre à faciliter la transcription ou la réplication.
5. Les SARs sont des sites de fixation pour la topoisomérase II, une enzyme démêlant les enchevêtrements de l’ADN qui tendent à se former lorsque les longs brins parentaux se détordent pour permettre la synthèse des brins- fils (Markley, 2006).
5-3- La transcription : Les étapes à suivre pour augmenter la production de la protéine ciblée sont les suivantes :
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Augmenter la production d’ARNm qui code pour la transcription du gène introduit.
Agir sur de nombreux facteurs impliqués dans la régulation de la transcription, en particulier sur les protéines interagissant avec l’ADN génomique.
Le caractère distinctif entre ces protéines, facteurs de transcription, est le motif structural qu’elles possèdent toutes et qui leur permet de venir se fixer sur l’ADN génomique. On parle de protéines à motif hélice- boucle- hélice, protéines portant une agrafe à leucine, protéines en doigt de gant coordonné au zinc, etc. Différents gènes codant pour ces facteurs cellulaires ont également été découverts. Ce sont des proto-oncogènes tels que le MYC ou le MYB (Lewin, 1999).
Beaucoup de protéines synthétisées pourraient être des enzymes qui trouveraient des substrats adéquats dans les plantes. Une régulation par rétroaction risque d’avoir lieu dans la plante, risquant de détourner les protéines néosynthétisées vers des sites non souhaités (rôle primordial joué par les promoteurs dans la transcription). Une des solutions pour éviter cette régulation négative de la production serait de stocker les protéines produites dans un compartiment cellulaire où leurs substrats ne sont pas présents (Berg & Singer. 1993).
La transcription est un mécanisme complexe qui, lorsqu’il sera parfaitement maîtrisé, permettra d’envisager le concept de production "inductible". En effet, en jouant sur l’induction de la
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transcription via les facteurs de transcription et les promoteurs, il serait possible d’obtenir une plante qui produit la protéine recombinée uniquement durant une courte période avant la récolte. Cela permettrait d’éviter que la synthèse de la protéine n’interfère en permanence avec la physiologie de la plante.
5-4- Les étapes post- transcriptionnelles : Une fois la synthèse d’ARNm est initiée, les manipulations biotechnologiques et génétiques sont les suivantes :
Coiffage : Une coiffe est ajoutée à ce préARNm en croissance. Il s’agit de l’addition de 7-méthylguanylate à l’extrémité 5’ de l’ARNm en cours de synthèse. Cela se fait via une liaison 5’-5’. Une des fonctions de cette coiffe est de protéger l’ARNm contre la dégradation opérée par les ARNases.
Polyadénylation : Après le coiffage, il faut faire une polyadénylation : une queue poly-A de 200 résidus environ est ajoutée à son extrémité 3’ par la poly-A polymérase. Cette queue a plusieurs fonctions pour l’ARNm : elle le protège des actions des ARNases, elle augmente sa stabilité dans le cytoplasme et elle est nécessaire à une traduction réussie sur les ribosomes. La coiffe et la queue poly-A sont également requises pour passer au travers de la membrane nucléaire.
Epissage : L’étape qui suit ces deux réactions (coiffage et polyadénylation) est l’épissage. Il consiste en l’excision des introns présents dans l’ARNm, ce qui le rend "lisible". Ces introns
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augmentent la stabilité de l’ARN. Cette stabilité permet d’envisager une meilleure production de la protéine recombinée.
Les ARNm possèdent également des séquences qui fonctionnent comme des éléments déstabilisants spécifiques. L’ARE est une de ces séquences. Elle est constituée d’un pentanucléotide AUUUA répété plusieurs fois et entraînant la désadénylation de l’ARNm, ce qui contribue à sa déstabilisation. La suppression des séquences déstabilisantes permettrait d’obtenir des ARNm plus stables.
Toutes les propriétés vues font que le coiffage, la polyadénylation et l’épissage sont des étapes-clef dans la stabilisation et la "lisibilité" de l’ARNm. Il conviendra donc de s’assurer que les enzymes impliqués dans ces réactions ne soient pas présentes en quantité limitante. L’ingénierie génétique aura aussi pour but d’éviter la présence de certaines séquences déstabilisantes dans les gènes intégrés (Kahn, 1997).
5-5- La traduction : Les principaux éléments sont les suivants :
La coiffe 5’ de l’ARNm semble être le premier signal reconnu par l’élément ribosomial qui déclanche l’amorçage du processus de traduction.
L’élément ribosomial se fixe au niveau de cette coiffe, il glisse le long de l’ARNm jusqu’à la rencontre d’un codon AUG qui est le codon d’amorçage.
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La séquence de Kozak, découverte par Marilyn Kozak, correspond à la séquence de nucléotide –ACCAUGG- qui précède le codon AUG.
Il semble que la coiffe 5’ et la séquence de Kozak augmentent la fréquence d’amorçage. Il est donc possible d’intégrer une séquence de Kozak dans l’ADN recombinant, ce qui a pour effet d’augmenter le taux d’initiation de la traduction et par la même occasion la production de protéine recombinée.
Souvent, on intègre également des promoteurs (de gène) d’origine virale car ils s’avèrent être des facteurs augmentant le taux de traduction (Chambond, 1985 ; Clausen, 2000).
Les principaux facteurs limitants pouvant subvenir sont les suivants :
1. Un manque d’ARNt compatible avec les séquences de l’ARNm. Il suffit alors de modifier le gène recombinant de sorte que l’ARNm, pour lequel il code, comporte des codons qui trouvent suffisamment de ARNt correspondants dans la cellule- hôte. Le gène modifié code alors pour une protéine qui est identique à celle de départ puisque les codons remplacés le sont par des "synonymes".
2. Les acides aminés peuvent également être un facteur limitant pour la traduction. Lorsque l’on désire produire une protéine particulièrement riche en un acide aminé, il est parfois recommandé de modifier les voies de biosynthèse de cet acide aminé lorsque celui-ci n’est pas présent naturellement
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en quantité suffisante dans la cellule- hôte (Cramer et al, 1999).
5-6- Étapes post-traductionnelles : Ces étapes sont cruciales pour la qualité des protéines recombinées. Si différentes étapes sont mal réalisées, on obtient des protéines non-conformes, ce qui les rend inutilisables dans le domaine médical et parfois dans le domaine industriel.
Le ciblage : Les principaux éléments de base sont les suivants : 1. Les protéines synthétisées doivent être localisées dans des
organites bien connus de la cellule.
2. Il faut donc conditionner leur localisation par des séquences « programmées ». Cette technique offre comme avantage de séquestrer les protéines afin d’éviter leur dégradation par des protéases cytoplasmiques ou leur interaction indésirable avec le métabolisme cellulaire.
3. Les biotechnologies actuelles permettent aussi de diriger les protéines recombinées synthétisées vers des organites déterminés (mitochondrie, chloroplaste, etc.) en leur associant une séquence spécifique de ciblage.
4. Après leur localisation et stockage, la séquence (de tête) doit être clivée. Si elle ne l’est pas, cela peut affecter la qualité de la protéine produite.
5. Il faut également que la protéine synthétisée soit au préalable envoyée vers le réticulum endoplasmique afin d’y subir la glycosylation (dont l’importance est connue) et la formation de
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ponts disulfure qui contribuent à la structure secondaire de la protéine. Le réticulum endoplasmique est donc souvent un passage obligé pour la protéine. Elle y rentre de manière co-traductionnelle, le ribosome, en train de synthétiser la protéine, s’associant au niveau du réticulum endoplasmique rugueux. 6. Les rares protéines ne nécessitant pas un passage par le
réticulum endoplasmique subissent une reconnaissance post-traductionnelle par les membranes des organites qui les stockent.
Reploiement et assemblage : Le réticulum endoplasmique contient plusieurs chaperons moléculaires (de nature protéique) qui aident les protéines néoformées à s’assembler, se replier de la manière la plus stable, ne pas se dégrader et s’organiser pour être transportées. Ces processus de reploiement sont consommateurs d’ATP. Le reploiement est une étape-clef dans l’activation des protéines recombinées et dans leur degré de conformité. L’expression simultanée de tous les gènes exprimant les différentes sous- unités de la protéine néoformée est nécessaire à son assemblage.
La dégradation protéique : Dans les cellules animales, il y a deux voies de dégradation : une dans des vacuoles digestives spécialisées appelées lysosomes et l’autre dans le cytosol. Les protéines destinées à être dégradées dans les lysosomes semblent
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posséder un message les y envoyant. Les lysosomes sont également capables de digérer des organites de la cellule. La vacuole des cellules végétales est riche en protéases et est l’équivalent végétal des lysosomes, mais jusqu’à présent il n’est pas démontré que les vacuoles végétales digèrent des organites ou participent à la dégradation des protéines cytosoliques, excepté durant la sénescence. La voie non lysosomiale de dégradation protéique, observée dans les cellules eucaryotes, implique que la protéine soit au préalable liée par covalence à un polypeptide de 76 acides aminés appelé ubiquitine. L’ubiquitinisation d’une protéine se fait sur des sites spécifiques et implique l’intervention de trois enzymes (E1, E2, E3). Une fois marquée, la protéine peut être reconnue par un complexe protéolytique appelé 26S protéosome.
Il existe plusieurs possibilités pour éviter la dégradation des protéines recombinées :
1. Exprimer la protéine recombinée dans les graines où les taux d’inhibiteurs de protéase sont élevés et donc susceptibles d’atténuer la dégradation protéique.
2. Élaborer des protéines restant dans le réticulum endoplasmique loin d’un contact avec des protéases.
3. Synthétiser des protéines ne possédant pas de sites spécifiques de reconnaissance par les protéases (site d’ubiquitinisation par exemple). Cette dernière solution impose certaines restrictions sur les protéines recombinées et pourrait donc poser des problèmes de conformité.
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4. Sélectionner des cellules possédant une faible activité protéolytique ce qui réduirait le taux de dégradation pour toutes les protéines synthétisées.
5-7- Technologie de l’extraction de la protéine d’intérêt : Une fois le gène d’intérêt est introduit dans le génome de la plante (transgenèse) et devient fonctionnel (bien intégré), plus la plante grandit, plus la fusion de l'oleosine/proteine d’intérêt (insuline), naturellement visée est capturée sur les corps lipidiques dans la graine. Plus la production des graines augmente, plus celle de l’oléosine/insuline, liée aux membranes des particules lipidiques contenues dans ces graines augmente aussi.
Pour l’extraction, se basant sur le principe que l'huile est plus légère que l'eau, la graine récoltée est moulue dans un tampon aqueux et les particules lipidiques sont purifiés des impuretés à travers une série de centrifugations simples et de processus de lavage à froid. Ces particules sont munies de leurs membranes protéiques qu’il faut dissocier des lipides. Ce sont ces membranes qui contiennent l’oléosine liée à l’insuline.
Afin de dissocier l’oléosine de la protéine d’intérêt (insuline), une enzyme et un produit chimique, reconnaissant bien le site de la fusion « oleosine/insuline » sont ajoutés aux particules lipidiques purifiées. Par une série de centrifugations, en phase aqueuse, à froid, on isole les protéines dissociées des lipides. Le secret professionnel empêche les scientifiques de divulguer le détail de cette information !
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Conclusion : Glycosylation, acétylation, acylation et phosphorylation sont des étapes qui jouent un rôle important dans la synthèse des protéines conformes. Les enzymes qui catalysent ces modifications devront donc être présentes en quantité suffisante dans les cellules de production. Les protéines recombinées produites dans les cellules végétales doivent subir une maturation qui les rend actives. Elles doivent également être traitées de manière à éviter leur dégradation, en les exprimant dans un compartiment cellulaire loin des protéases ou en présence d’inhibiteurs de ces protéases. Ces protéines doivent ensuite être extraites puis purifiées pour leur utilisation.
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Chapitre VI : L’Insuline
6-1- Introduction : Cette hormone pancréatique a été bien étudiée au Maroc (Ismaili Alaoui, 2005 ; El Jabiri, 2005 ; Sellam, 1999) et ailleurs (Kaaks, 2001 ; Giroud & Assan, 1988). Les insulines actuellement disponibles sur le marché sont dites humaines ; elles sont obtenues par recombinaison génétique ; elles sont ensuite hautement purifiées afin d’être tolérantes sur le plan de l’immunogénicité. L’historique de l’insuline est bien décrit dans la thèse 92 disponible à la Faculté de médecine et de pharmacie de Rabat (Ismaili Alaoui, 2005) ; il a donc été opportun d’en extraire l’essentiel dans le présent chapitre.
Par ailleurs, l’insuline est produite dans les cellules « Beta » qui constituent 75 % des îlots de Langerhans du pancréas. Les cellules « alfa » sécrètent le glucagon, les cellules « gamma » la somatostatine. L’insuline est synthétisée sous forme d’une chaîne polypeptidique unique : la pré -pro -insuline qui se transforme en pro –insuline qui, elle-même, sous l’influence de protéases appelées « furines » donne l’insuline et le peptide C. Liée à deux atomes de Zinc, elle est stockées dans des granules sous forme d’un polymère (hexamère, probablement).
6-2- La pro- insuline et la maturation de l’insuline : La pro-insuline humaine, produite dans les cellules végétales, présente les caractéristiques suivantes :
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Onze acides aminés C terminaux supplémentaires, assurant la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique.
La séquence codant pour la pro- insuline est fusionnée avec le gène codant pour l’oléosine de l’espèce végétale Arabidopsis sp., ou Carthamus tinctorius, de manière à ce qu’elle ne soit exprimée que dans les graines.
L'expression du gène fusionné est commandée par les séquences d’un promoteur et d’un terminateur de la phaséoline du haricot commun.
Le promoteur du haricot conduit la transcription de la pro- insuline synthétique de façon spécifique au niveau de la graine (Faye et al, 2001).
Un marqueur de sélection est régulé par le promoteur et le terminateur de l'ubiquitine du persil ; ceci a fait l’objet d’une classification comme information commerciale confidentielle, bien que ce marqueur de sélection soit le plus communément utilisé comme marqueur de sélection chez les plantes, d’une part, et qu’il ait déjà été employé dans beaucoup d'expérimentations antérieures, d’autre part.
Cette pro- insuline est le précurseur de l'insuline, normalement élaborée dans les cellules bêta des îlots de Langerhans au niveau du pancréas humain (Ruhlman et al, 2007).
La protéine est synthétisée dans le réticulum endoplasmique où elle est repliée et 2 groupes sulfhydriles (-SH) sont oxydés en une liaison (pont disulfure -S-S-).
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Elle est alors transportée vers l'appareil de Golgi où elle subie une dernière étape de glycosylation (liaison covalente d'oses aux protéines) ; elle est ensuite empaquetée dans les vésicules sécréteuses et transformée par une série de protéases en une insuline mature (Davidson, 2004).
L'insuline mature possède 39 acides aminés en moins par rapport à la pro- insuline, dont 4 sont complètement enlevés et les 35 acides aminés restants (C-peptide) sont coupés au milieu de la molécule de pro-insuline. Les deux extrémités de segments (chaînes B et A) demeurent reliées par la liaison disulfure formées antérieurement.
L'insuline humaine, produite dans les graines de l’espèce des crucifères, Arabidopsis sp ou des astéracées (composées), Carthame est activée par exposition à la trypsine, une enzyme digestive (Nykiforuk et al, 2006).
6-3- Structure biochimique de l’insuline et son historique : L’insuline présente la structure suivante (fig. 6) :
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Fig. 6 : Structure biochimique de l’insuline
En 1922, Frederick Grant Banting et Charles H. Best injectent un extrait pancréatique - contenant de l’insuline qu’ils viennent de découvrir - à un jeune garçon de quatorze ans souffrant de diabète. C’est un véritable succès, qui vaut le prix Nobel aux deux inventeurs et qui suscite immédiatement une importante demande.
Hormone peptidique à deux chaînes d'acides aminés : une chaîne A de 21 acides aminés et une chaîne B de 30 acides aminés.
Sécrétée par le pancréas (cellules ß des ilôts de Langerhans) au cours de la digestion, dès que le taux de glucose dans le sang (glycémie) dépasse 6.10-3 M.
Hormone hypoglycémiante : elle favorise le retour de la glycémie à la valeur basale de 5.10-3 M.
L'insuline active le mouvement des transporteurs de glucose dans les membranes plasmiques, ce qui favorise le transport actif du glucose vers le cytoplasme.
L'insuline diminue les taux des messagers secondaires dans de nombreux tissus : AMPc et Ca++, ce qui entraîne les effets suivants :
o activation de la glycogénogénèse
o inhibition de la glycogénolyse
o inhibition de la gluconéogénèse (action antagoniste de celle du glucagon et du cortisol)
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o inhibition de la lipolyse