2. Matériels et méthodes
2.2. A NALYSES DE LABORATOIRE
Pour les analyses de laboratoire, une des espèces de poissons les plus consommées a fait l’objet de cette étude. Il s’agit du chinchard (Trachurus spp) appelé « Kpoku » en langue vernaculaire « Gun et Mina ». Ces analyses de laboratoire ont porté essentiellement sur les analyses microbiologiques et physico-chimiques des échantillons prélevés trois lieux à savoir:
- l’une des poissonneries les plus exploitées par les transformatrices du marché Ouando (d’après les résultats d’enquête) pour le poisson frais ;
- à Songhaï et sur le site de production du marché Ouando pour les poissons fumés.
2.2.1. Collecte des échantillons
Au total, neuf kilogrammes (9Kg) de poissons frais ont été acheté. Trois kilogrammes (03) ont été envoyé au fumage sur le site de fumage du marché de Ouando ; trois autres kilogrammes ont été envoyé au fumage au centre songhaï et les trois (03) kilogrammes de poissons frais restants ont été directement envoyé au laboratoire pour analyse. Les poissons fumés ont été prélevé juste après leur fumage. Le prélèvement du poisson fumé a été effectué après son conditionnement dans des bassines (Songhaï) et des paniers (transformation au Marché). Chaque unité de poisson pèse environ 600 - 800 grammes (g). Les échantillons prélevés sont mis dans des sachets stériles, puis mis dans d e s glacières. Des gants stériles ont été utilisés lors du prélèvement des échantillons. Pendant l’analyse de chaque échantillon, les prélèvements, pour préparer la solution mère en ce qui concerne l’analyse microbiologique ou pour préparer le broyat en ce qui concerne l’analyse physico-chimique, se font à différents endroits sur la chair du poisson (la tête, le milieu, la queue, etc.).
2.2.2. Analyses microbiologiques
Elles ont porté sur le dénombrement de la Flore Mésophile Aérobie Totale, des bactéries Anaérobies Sulfito-Réducteurs, des Coliformes Totaux et Fécaux, des Salmonelles, des Levures et Moisissures et des Staphylocoques à Coagulase Positive.
2.2.2.1. Prélèvement pour l’analyse
Les parties superficielles et profondes des poissons ont été prélevées à l’aide de ciseaux et de pinces stériles à proximité du bec bunsen allumé. Cette opération consiste à prélever de manière aseptique, des fractions des poissons (au niveau de la tête, du milieu et de la queue) choisis au hasard jusqu’à obtenir un poids de 25 g. La fraction ainsi prélevée est utilisée pour la préparation de la solution- mère.
2.2.2.2. Préparation de la solution mère (NFV 08-010 mars 1996)
Vingt-cinq (25) grammes d’échantillon sont prélevés puis introduits dans le sac à STOMACHER. On y ajoute une solution de l’EPT (Eau Peptonée Tamponnée) préalablement stérilisée jusqu’à obtenir une masse totale de 250 grammes.
Ce mélange est agité ou passé au STOMACHER pendant 2 à 3 minutes. La solution obtenue appelée solution mère est laissée au repos pendant 30 minutes pour assurer la revivification de germes stressés par l’homogénéisation.
2.2.2.3. Dilutions décimales
Un millilitre (1ml) de la solution mère est prélevé et introduit dans un tube à essai contenant 9 ml du diluant (EPT). On obtient une solution de dilution 10-2. Un millilitre (1ml) de la solution 10-2
est de nouveau prélevé puis introduit dans un autre tube contenant toujours 9 ml de du diluant désiré (EPT). La dilution de la solution ainsi obtenue est 10-3. 2.2.2.4. Recherche et dénombrement de la Flore Mésophile Aérobie Totale (FMAT)
(ISO 4833 de Fév. 2003)
Le milieu Plate Count Agar (PCA) est la gélose standard habituellement utilisée pour le dénombrement de cette flore. On transfère aseptiquement 1 ml de suspension de chaque tube des dilutions 10-1 et 10-2 dans les boites de pétri stériles. Le milieu PCA, fondu et refroidi au bain-marie à 45°C, est ajouté à l’inoculum à raison de 12 à 15ml par boite. Ensuite, on homogénéise le mélange par des mouvements rotatifs. Après solidification, une deuxième couche de 5 à 7 ml de PCA est ajoutée. Cette deuxième couche résulte de la faible sélectivité du PCA. Elle permet d’éviter l’envahissement de la boite par des germes comme proteus, qui rendraient la lecture difficile. Les boites ayant la gélose solidifiée sont ensuite incubées, couvercles tournés vers la clayette de l’étuve à 30°C pendant 72 heures. On dénombre toutes les colonies ayant poussé entre les deux couches à l’aide d’un compteur de colonies muni d’une loupe ou à l’œil nu. Le comptage se fait après 72 heures d’incubation. Les colonies caractéristiques apparaissent blanchâtres.
2.2.2.5. Recherche et dénombrement des Coliformes Totaux CT (ISO 4832 de 1991) et des Coliformes Fécaux CF (NF V08-60 de Mars 1996)
Avant de commencer la recherche, il faut inscrire CT 1 ml et CF 1 ml ainsi que le numéro de l’échantillon sur la boîte de Pétri, mettre 1 ml de la solution mère dans chacune d’elle puis couler 15 à 20 ml de VRBA et répartir l’inoculum par des mouvements circulaires. On la laisse se solidifier et on met une nouvelle couche de 5 ml de VRBA (Violet Red Bile Agar) puis on la laisser se solidifier. Après ça, il faut séparer les CT des CF et incuber les CT à 30°c et CF à 44°c pendant 24 heures. Après incubation de 24h, les colonies de coliformes totaux et fécaux apparaissent rouges foncées.
2.2.2.6. Recherche et dénombrement des staphylocoques à coagulase positive (ISO 6888 - 2 d’Octobre 1999)
Le milieu de culture de choix employé pour cette recherche est celui de Baird-Parker (BP). La gélose BP, fondue puis refroidie, est coulé dans des boites de pétri stériles. Après solidification du mélange, 0,1 ml de la suspension mère ou des dilutions décimales, est étalé
à la surface à l’aide d’un étaleur stérile en verre ou en plastique. L’incubation se fait à 37 °C pendant 24 heures. Les colonies de staphylocoques sont noires, brillantes, bombées,
entourées d’un précipité blanc et d’un halo d’éclaircissement. La confirmation est obtenue par les tests de la catalase et de la coagulase.
NB : Nous n’avons pas effectué les tests car aucune colonie caractéristique n’a été détectée.
2.2.2.7. Recherche et dénombrement des bactéries anaérobies sulfito-réductrices (ISO 7937 de Avril 1997)
Ce sont les formes sporulées qui sont recherchées. Deux milieux sélectifs peuvent être utilisés: Gélose Trypticase Sulfite Néomycine (TSN) ou gélose Trypticase Cyclosérine (TSC).
C’est le TSN qui a été utilisé pour l’étude. L’ensemencement du milieu TSN pour la recherche des ASR se fait en tubes. Le milieu TSN fondu et refroidi au bain-marie, est coulé à raison de 20 ml par tubes. 1 ml de suspension mère à 10-1 et 1 ml de dilution à 10-2 sont transférés dans les tubes stériles. Après homogénéisation et solidification, une deuxième couche est coulée.
Les tubes ayant la gélose solidifiée sont incubés en anaérobiose à 37°C pendant 24 heures.
Les colonies caractéristiques apparaissent noires dans les tubes d’incubation et sont dénombrées.
2.2.2.8. Recherche et dénombrement des salmonelles (norme ISO 6579/A1: juillet 2007) La recherche et le dénombrement de salmonelle font appel à plusieurs milieux de culture (milieux Rapport Sélénite-Cystine, hecktoen, gélose nutritive, galerie API 20 E) et se déroulent en plusieurs étapes. Le pré-enrichissement, qui consiste à incuber la solution mère (25g de l’échantillon pour 225 ml d’EPT) à 37°C pendant 24 h. Après les 24h, pipeter 18 ml de tétra-thionate ou de Sélénite-cystine dans un tube à essais convenable et ajouter 2 ml du pré-enrichissement puis l’incuber le tube à essais à 37°c pendant 24h : c’est l’enrichissement. Après 24h, couler le milieu SS (Salmonella-Shigella) ou Hecktoen dans une boîte de pétri à usage unique, le laisser se solidifier puis ensemencer SS ou Hecktoen par strie Z (zigzag) : c’est l’isolement. La lecture se fait après 24 heures d’incubation à 37°C. Les colonies purifiées apparaissent blanchâtres.
NB : Nous ne sommes pas allé jusqu’à l’identification car nous n’avons pas eu des cas de présence de salmonelles.
2.2.2.9. Recherche et dénombrement des levures et des moisissures (norme ISO 7954 de Nov. 1987)
Le dénombrement de la flore fongique a été réalisé sur gélose glucose à l’Oxytétracycline (OGA). Une prise de 15 ml de la gélose OGA est coulé dans des boites de pétri vidées et stérilisées. Après solidification, les boites sont ensemencées avec 0.1 ml des dilutions 10-1 et 10-2 à partir de la solution - mère (SM) en surface puis incubées à la température de 25°C pendant 3 à 5 jours. La lecture permet d’apprécier 3 types de colonies :
Les levures dont l’aspect rappellent celui des colonies bactériennes. Elles sont rondes à contours réguliers, opaques, plates en surface et lenticulaires en profondeur ;
Les oïdiums d’aspect velouté qui font penser aux moisissures ;
Les moisissures souvent pigmentées, d’aspect velouté, plus ou moins proéminents.
2.2.3. Méthode d’interprétation des résultats
L’interprétation des résultats se fera suivant un plan à 3 classes pour la flore mésophile aérobie totale, les coliformes totaux et fécaux, les germes anaérobies sulfito-réducteurs et les levures et moisissures en tenant compte des critères.
Un échantillon est qualifié de qualité microbiologique satisfaisante (QMS) si la flore F est inférieure ou égale à 3 m (F ≤ 3 m); de qualité microbiologique acceptable (QMA) si F est comprise entre 3m et 10m (3 m ≤ F ≤ 10 m) et de qualité microbiologique non satisfaisante (QMNS) si F est supérieure à 10 m (F > 10 m); m étant le critère microbiologique du Tableau 4.
Pour les salmonelles, l’interprétation se fera suivant un plan à 2 classes.
La présence des salmonelles indiquera que l’échantillon est de QMNS. L’échantillon sera de QMS si elles sont absentes.
Tableau 4 : Critères microbiologiques des poissons frais, congelés et fumés destinés à la consommation humaine, utilisés au laboratoire de microbiologie de la DANA
Il est important de connaitre les caractéristiques physico-chimiques de la matière première pour une bonne application des techniques de production. Dans le cadre de notre étude, seul l’Humidité nous a intéressé.
Types de Produits Microorganismes (UFC/g)
FMAT Salm. Staph. CT CF ASR L/M
Poissons frais ou congelés 105 Abs/25g 103 10 10 10 102 Produits fumés : fin de la transformation 105 Abs/25g 102 10 10 10 102
Sources Jouve 1996
Ce matériel et ces méthodes nous ont permis d’obtenir les résultats ci-après.