Évolution du protocole de propagation

Différents protocoles de propagation ont été utilisés afin d’inoculer les milieux de fermentation testés lors des multiples séries d’essais présentées dans ce rapport (Annexe A : Tableau synthèses des biocatalyseurs). Un total de 6 protocoles ont été mis à contribution et ces derniers sont détaillés ci-après en ordre décroissant du niveau de stress appliqué aux levures : #F étant le plus stressant et #A le moins stressant.

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Tableau 3.4 : Détails des protocoles de propagation de levures utilisés durant les diverses séries d'essais*

*Acronymes : YUD – Concentrations d’extrait de levure (Y), d’urée (U) et de glucose (D)

La Tableau 3.4 présente un résumé des protocoles utilisés afin de propager les levures pour les différentes séries d’essais présentées dans ce rapport. L’indice de stress reflète la sévérité du stress appliqué aux levures en utilisant ce protocole et il est supposé que plus le stress est élevé, moins les performances de fermentation seront bonnes.

L’« Étape d’incubation » donne les conditions de la propagation initiale, durant laquelle les cellules sont multipliées dans un faible volume de milieu de culture liquide à partir de 1 colonie prélevée sur un plat de Pétri. « YUD » signifie « Yeast Extract : Urea : Dextrose » et donne la composition en g/L de ces trois composants du milieu de culture. Cette étape devrait être la plus courte possible afin de maximiser la vitalité cellulaire pour la prochaine étape en plus de limiter le nombre de générations. Par contre, elle ne devrait pas être si courte que la biomasse générée ne suffit pas à inoculer l’étape de propagation. De plus, lorsqu’on travaille avec un OGM, il est préférable de limiter le nombre de générations lors de la propagation dû au risque de perte du bagage génétique exogène, particulièrement dans un milieu de culture ne contenant que du glucose, où il n’y a aucune pression favorisant le maintien d’une voie catabolique du xylose. Les expériences ont montré qu’une durée de 24h est suffisante pour cette étape, donc, une durée de 60h peut être interprétée comme un stress inutile.

L’« Étape de propagation » est l’étape où la culture de l’étape d’incubation est transvidée dans un milieu de culture frais plus volumineux. L’« aération » signale que le milieu a été aéré avec de l’air ou non, la propagation s’effectuant en mode aérobique ou anaérobique. La durée de cette étape est encore plus critique que celle de l’étape d’incubation. Effectivement, si la durée de la propagation est trop longue, les levures consomment tous les sucres, amorcent leur phase de croissance stationnaire et peuvent même entrer dans leur phase de déclin. Cela signifie une baisse dramatique d’activité cellulaire et le début de la mort cellulaire. Or, une propagation optimale utilisée pour inoculer un milieu de fermentation éthylique devrait être prélevée durant la fin de la phase de croissance exponentielle. Des tests de sucres résiduels ont été réalisés durant cette étape de la propagation et il a été trouvé que dans les cas des protocoles #C

Indice de stress YUD (g/L) Durée (h) YUD (g/L) Durée (h) Aération

(Oui/Non) T (°C) Méthode de transfert

Durée entre centrifugation et inoculation

(h)

Série d'essais utilisant ce

protocole

F 10:1:80 60 10:1:80 24 Non 4 Suspension dans l'eau 24<t>1 #2, 3, 4, 5, 7

E 10:1:60 60 10:1:60 24 Non 4 Suspension dans saline

PBS t<1 #1

D 20:1:80 60 20:1:80 24 Non 4 Transfert direct de la

pâte de levure 24<t>1

#6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14

C 25:1:50 24 20:1:80 10 Oui 4 Transfert direct de la

pâte de levure t<1 #15, 16

B 25:1:50 24 20:1:80 10 Oui 20 Transfert direct de la

pâte de levure t<1 #16, 17, 18

A 50:1:100 24 60:1:150 10 Oui s/a Transfert direct du

milieu de propagation t<0.25 #19

Étape d'incubation

initiale Étape de propagation

Étape de centrifugation et transfert dans le milieu de fermentation

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et #B, le glucose était complètement consommé après 10h (résultats non montrés). C’est pourquoi la concentration en glucose de l’étape de propagation du protocole #A a été augmenté à 180 g/L et une analyse de sucres résiduels a montré qu’après 11.3h de culture, il restait 32 g/L de glucose (résultats non montrés). Il est conclu qu’une durée de 24h est beaucoup trop longue pour cette étape, et qu’une durée de 10h est préférablement jointe à une concentration en glucose de >150 g/L afin d’éviter une carence en sucre pour les levures.

L’« Étape de centrifugation et transfert dans le milieu de fermentation » détaille les étapes suivant la propagation afin de préparer l’inoculum. L’inoculum est ensuite utilisé pour inoculer les milieux de fermentation. La « T (°C) » est la température de centrifugation du milieu de propagation; un « s/a » signifie qu’il n’y a pas eu de centrifugation. La « méthode de transfert » détaille s’il y a eu une re- suspension des cellules dans une solution avant leur utilisation comme inoculum. Par exemple, pour le protocole de propagation #E, le milieu de propagation fut centrifugé, le surnageant jeté, les cellules re- suspendues avec une solution saline PBS, puis cette solution fut utilisée directement pour inoculer les milieux de fermentation testés dans la série d’essais #1. La « durée entre centrifugation et inoculation » est une estimation du temps entre la fin de la préparation de l’inoculum et l’utilisation de ce dernier dans les fermentations testées. Afin de limiter le stress subit par les cellules durant cette étape, il est clair que de ne pas centrifuger les cellules est la meilleure solution. Si une centrifugation est utilisée, il est préférable de centrifuger les cellules à une température la plus proche possible de la température utilisée lors de la propagation (32 °C). Finalement, il est beaucoup plus dommageable pour les cellules de se faire re-suspendre dans une solution très différente du milieu duquel elles viennent d’être centrifugées. En ce sens, re-suspendre les cellules dans de l’eau est plus stressant que dans une solution saline PBS, qui est aussi plus stressant qu’aucune re-suspension. Ce sont ces raisons qui justifient la gradation du niveau de stress des 6 protocoles utilisés.

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