Haut PDF étude structurale et fonctionnelle de la protéine KIN17 humaine

étude structurale et fonctionnelle de la protéine KIN17 humaine

étude structurale et fonctionnelle de la protéine KIN17 humaine

protéine KIN17 n’est probablement pas un composant essentiel du spliceosome et qu’elle peut intervenir faiblement et de manière transitoire dans les mécanismes d’épissage des ARN pré- messagers. Devant les doutes sur le rôle éventuel de la protéine KIN17 dans l’épissage, le Pr. R. Lührmann nous a proposé d’effectuer un autre type d’expérience. Pour cela, des essais été effectués dans le laboratoire du Pr. M. Carmo-Fonseca de l’Institut de Médecine Moléculaire de l’Université de Lisbonne (Portugal) pour voir si la protéine KIN17 est recrutée au niveau des sites de transcription du gène beta-globine dans des cellules de souris. La méthode développée par cette équipe (Custodio et al. 2004) a déjà permis de montrer que les protéines du complexe de jonction d’exon (EJC) co-localisent avec des composants du spliceosome aux sites de transcription et d’épissage dans le nucléoplasme. L’épissage des ARN pré-messagers du gène beta-globine est nécessaire pour un recrutement efficace de l’EJC et le ciblage ultérieur des mRNPs résultants aux voies d’export nucléaire. Les premiers essais où la présence de la protéine KIN17 était recherchée par immunofluorescence ont bien marché techniquement mais n’ont pas permis de détecter une accumulation de la protéine au site de transcription du gène beta-globine. Cela peut indiquer que la protéine se lie de manière transitoire pour un temps très court aux transcrits naissants. Cependant, nous ne pouvons pas exclure la possibilité que l’épitope de la protéine ne soit pas accessible à l’anticorps lorsque la protéine s’assemble au transcrits naissants. Des essais supplémentaires ont été effectués avec des cellules de souris transfectées avec un vecteur codant pour la protéine KIN17 avec une étiquette GFP, mais les résultats sont les mêmes que précédemment. En conclusion, à l’heure actuelle, nous n’avons pas réussi à montrer de manière non ambigue que la protéine hKIN17 a un rôle dans les mécanismes d’épissage des ARN pré-messagers.
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Maturation de la capside du bactériophage T5 : étude structurale et fonctionnelle de la protéine de décoration pb10

Maturation de la capside du bactériophage T5 : étude structurale et fonctionnelle de la protéine de décoration pb10

138 Optimisation de la production de capsides Les conditions d’obtention des capsides vides expansées et décorées doivent être optimisées en vue d’une utilisation pour des applications médicales ou en biotechnologie. En effet, la procédure actuellement utilisée au laboratoire consiste à produire des capsides compactes par infection d’E. coli avec un phage mutant, purifier ces procapsides, les expanser et enfin les décorer avec des protéines de décoration modifiées produites et purifiées séparément. Il serait plus direct et rapide de produire des capsides recombinantes en utilisant un plasmide contenant les gènes nécessaires à la synthèse des capsides, comme cela a été développé pour les virus-like particles de P22 [97]. Cette stratégie a été récemment utilisée et a permis de démontrer que, dans le cas de T5, la protéase de maturation pb11 ainsi que la portale pb7 sont toutes les deux nécessaires en plus de la protéine majeure de capside pb8 pour former des capsides icosaédriques régulières [151]. Le plasmide utilisé est un pET-28 contenant les 4 gènes codant pour pb7, pb10, pb11 et pb8 dans l’ordre dans lequel ils sont dans le génome de T5, sous contrôle du promoteur T7. Des optimisations de promoteur et de plasmide (nombre de copies) sont nécessaires pour trouver le bon niveau d’expression de ces gènes permettant la formation d'un nombre suffisant de capsides.
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Étude fonctionnelle et structurale de certains domaines des spectrines érythroïdes et non érythroïdes : site de tétramérisation et domaine SH3

Étude fonctionnelle et structurale de certains domaines des spectrines érythroïdes et non érythroïdes : site de tétramérisation et domaine SH3

Une à deux boîtes de diamètre 100 mm de cellules RCCD 1 non transfectées ou surexprimant le domaine SH3 de la fodrine (clone L5) ont été lysées dans le tampon précédemment décrit par Rotin et coll. (1994). Ce tampon contient : HEPES 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, MgCl 2 1,5 mM, EGTA 1 mM, glycérol 10 %, Triton X-100 1 %, aprotinine 10 µg/ml, leupeptine 10 µg/ml, pepstatine 10 µg/ml, inhibiteur de trypsine 10 µg/ml et PMSF 1 mM. La lyse a été réalisée en ajoutant 150 µl de tampon pour chaque culot de cellules correspondant à une boîte de culture (5-10 x 10 6 de cellules), en agitant vigoureusement pendant une minute. Le lysat a été conservé dans la glace pendant 20-30 minutes puis centrifugé à 14 000 rpm pendant 15 minutes (4°C) deux fois. Une fraction du lysat de départ (1/3) a été incubée dans le tampon d’électrophorèse et bouilli pendant 3 minutes. Le culot insoluble collecté après la première centrifugation du lysat a été repris dans une solution Tris-HCl 100 mM (pH 6,8), MgCl 2 100 mM, SDS 4 %, glycérol 10 %, βME 5 %, bleu de bromophénol 0,01 % afin de solubiliser une partie des protéines, puis incubé à 100°C pendant 3 minutes. La solution d’anticorps anti-FLAG couplés aux billes de sépharose (Kodak) a été ajoutée dans les 2/3 restants du lysat clair (60 µg d’anticorps pour 100 µl de lysat). Le mélange a été incubé à 4°C pendant 4 heures et mélangé par rotation. Les billes de sépharose/anticorps ont été collectées par centrifugation légère (4°C) et lavées trois fois avec le tampon de lyse. Le culot de billes a été ensuite mélangé au tampon d’électrophorèse et bouilli pendant 3 minutes. Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE (gel acrylamide 5-15 %). La révélation de la fodrine et du peptide SH3 surexprimé a été réalisé par immunotransfert avec des anticorps anti-SH3 fodrine purifiés (1/1 000 000) comme précédemment décrit. La membrane a été ensuite traitée en Tris-HCl 25 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, SDS 2 % et βME 100 mM à 60°C pendant 30-40 minutes pour décrocher les anticorps anti-SH3 fodrine puis la protéine α rENaC a été révélée par immunotransfert avec un sérum de lapin anti-αrENaC précédemment décrit (1/5 000).
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Caractérisation structurale et fonctionnelle d'AGP31, une glycoprotéine atypique de la paroi chez Arabidopsis thaliana

Caractérisation structurale et fonctionnelle d'AGP31, une glycoprotéine atypique de la paroi chez Arabidopsis thaliana

GLYCOPROTEINE ATYPYQUE DE LA PAROI CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA DIRECTEURS DE THESE : Dr. Elisabeth JAMET et Dr. Cécile ALBENNE RESUME La paroi cellulaire végétale est une structure dynamique constituée de réseaux de polysaccharides et de protéines dont l’organisation supramoléculaire est complexe. AGP31, codée par At1g28290, a été identifiée comme une protéine multi-domaines abondante dans la paroi des cellules des hypocotyles étiolés d’Arabidopsis thaliana. Mon travail de thèse a consisté à élucider la structure et la fonction d’AGP31. La caractérisation structurale du domaine riche en Pro d’AGP31 a été effectuée : des résidus Hyp et des O-galactanes ont été localisés par spectrométrie de masse. AGP31 a été trouvée sous plusieurs glycoformes différant par le type et la taille des O-glycanes et/ou la longueur de la chaîne polypeptidique. Des tests in vitro ont montré des interactions entre différents domaines d’AGP31 et des polysaccharides pariétaux (HG méthylestérifiés, galactanes du RGI). Une remarquable affinité entre les O-galactanes d’AGP31 et la lectine PNA a été montrée, indiquant de possibles interactions avec des lectines pariétales. Le patron d’expression d’At1g28290 suggère un rôle de renforcement des parois lors de l’émergence de la radicule et de l’élongation rapide des hypocotyles étiolés. Cependant, l’étude de plantes ARNi sous-expresseurs et sur-expresseurs d’Atg28290 n’a pas permis de trouver un phénotype au cours du développement, probablement du fait d’une redondance fonctionnelle avec des gènes proches d’At1g28290. Ce travail constitue la première caractérisation structurale d’un domaine riche en Pro d’une protéine pariétale et permet de proposer qu’AGP31, via ses différents domaines, interagisse en réseau dans les parois avec elle-même, des polysaccharides ou des lectines.
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Caractérisation fonctionnelle de la protéine ANKS3 impliquée dans les ciliopathies rénales et étude de son rôle dans la régulation des ARNs

Caractérisation fonctionnelle de la protéine ANKS3 impliquée dans les ciliopathies rénales et étude de son rôle dans la régulation des ARNs

IV.3.3. ANKS6 Comme déjà initié, les protéines de la famille ANKS tel qu’ANKS6 ou ANKS3 sont caractérisées par la présence des répétitions des motifs Ankyrine mais aussi par la présence d’au moins un domaine SAM (cf Figure 14: Structure et interactions d’ANKS3, ANKS6 et BICC1 ). Ainsi la protéine ANKS6 contient 11 répétitions de domaine Ankyrine en son extrémité N terminale et un domaine SAM en son extrémité C terminale, quand la protéine ANKS3 contient 6 répétitions de domaine Ankyrine et un domaine SAM suivi de 168 acides aminés à l’extrémité C terminale (cf Figure 14: Structure et interactions d’ANKS3, ANKS6 et BICC1 ). Elle présente donc une forte homologie structurale avec la protéine ANKS3 et leur deux types de domaines identifiables leur permettent d’interagir l’une avec l’autre via les interactions ANK/ANK et SAM/SAM. L’identification des partenaires protéiques d’ANKS6 et la caractérisation de leurs rôles biologiques au sein du tissu rénal contribue à la compréhension des mécanismes de kystogénèse. Ainsi les interactions entre ANKS6 et les protéines associées à la NPH tel que INVS, NEK7, NEK8 ou encore NPHP3 supportent le rôle de ANKS6 dans la physiopathologie des maladies kystiques (Czarnecki et al., 2015; Hoff et al., 2013). Plusieurs mutations de ANKS6/NPHP16 ont déjà été reportées (Hoff et al., 2013; Taskiran et al., 2014) et selon leur nature et leur localisation, elles entrainent des phénotypes de sévérité variable. Ces mutations incluent des mutations tronquantes dans le domaine SAM et une mutation faux-sens dans les domaines ANK associées respectivement a des formes syndromiques ou isolés de polykystoses rénales tandis qu’une mutation d’un site d’épissage induisant la perte du dernier exon a été retrouvée chez une famille présentant une NPH juvénile. Une mutation homozygote induisant un décalage du cadre de lecture (c.1010_1011del, p.G337Afs*16) entraine un phénotype létal similaire aux mutations perte de fonction de NEK8, à savoir des reins kystiques associés à une fibrose pancréatique, un situs
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Caractérisation structurale et fonctionnelle de la peptide déformylase du phage Vp16T

Caractérisation structurale et fonctionnelle de la peptide déformylase du phage Vp16T

certaines PDF1A, comme la peptide déformylase humaine 178 . De plus, aucune insertion particulière n’est observable par rapport à la séquence d’EcPDF et des PDFs de type 1B en général. Cependant, l’extrémité C-terminale diffère puisque elle ne présente pas l’extension permettant le repliement sous forme d’une hélice α. Une étude précédemment réalisée avec EcPDF indique que la protéine peut être active en dépit de l’absence de son hélice α3 C- terminale, tant que la délétion n’a pas lieu trop près du motif 3 permettant la structure du site actif. Ainsi chez EcPDF, une délétion en amont du 139 ème acide aminé (Val) aboutit à une perte totale d’activité alors qu’une délétion à partir du résidu 141 (Lys) n’empêche pas la complémentation in vivo du gène endogène 92 . Le dernier acide aminé des déformylases de phage (Ile) correspond au 143 ème acide aminé d’EcPDF (Figure I-1A), ce qui signifie que malgré leur très courte séquence, celle-ci sont potentiellement d’une taille suffisante pour coder une protéine active. Finalement, les séquences des PDFs des phages Vp16T et Vp16C ne montrent pas de mutation dans les motifs conservés du site actif, ne présentent pas d’insertion particulière suggérant un repliement différent d’EcPDF, et l’extrémité C-terminale très courte ne semble pas rédhibitoire pour la conservation de l’activité de la protéine. Il est donc probable que le gène des peptides déformylases identifié chez ces phages code pour deux enzymes actives.
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Caractérisation structurale et fonctionnelle d'un allergène de la noix (Juglans regia)

Caractérisation structurale et fonctionnelle d'un allergène de la noix (Juglans regia)

Dans l’UV proche (250 nm-300nm), les résidus aromatiques des chaînes latérales ainsi que les ponts disulfure sont les principaux chromophores. Dans l’UV lointain (160- 250nm), les liaisons interpeptidiques sont la base de l’analyse du contenu et du type des structures secondaires. L’étude de nombreux peptides de structure connue (Woody 1995) a montré que l'allure d'un spectre CD dépend de l'organisation locale de la liaison peptidique, ce qui permet donc de distinguer hélices α, feuillets β (parallèles ou antiparallèles), “ coudes ” et structures aléatoires (figure 9). Le spectre d'un polypeptide replié essentiellement en hélice α présente trois bandes caractéristiques: une bande positive de forte intensité à 190nm et deux bandes négatives à 208nm et 222nm. Le spectre obtenu avec un polypeptide replié en feuillet β possède une bande positive à 195nm et une bande négative à 218nm. A concentration en protéine égale, l'intensité de ces bandes est souvent moindre par rapport à celle des hélices α . La nature des chaînes latérales et le type de feuillets β (parallèles, antiparallèles...) peuvent modifier légèrement l'amplitude et la position des bandes observées. Le spectre obtenu avec un polypeptide non structuré (« random coil » ou aléatoire) montre une bande négative caractéristique aux alentours de 200nm et un épaulement positif vers 215nm. En se référant à des spectres de protéines de structures connues, il est possible d'estimer les pourcentages respectifs des structures secondaires présentes dans les protéines à partir de leur spectre de CD.
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Étude structurale et fonctionnelle de glycoside hydrolases et d'une iodo-péroxydase de la flavobactérie marine Zobellia galactanivorans, impliquées dans l'interaction avec les algues

Étude structurale et fonctionnelle de glycoside hydrolases et d'une iodo-péroxydase de la flavobactérie marine Zobellia galactanivorans, impliquées dans l'interaction avec les algues

G4S et le DA, et ce, avec un rapport de 2 pour 1. Ceci suggère que l'enzyme fixe strictement un G4S en +1 ou -1, selon que l'enzyme fonctionne par inversion ou rétention de configuration anomérique. En revanche, l'enzyme est moins spécifique en ce qui concerne le groupe partant. Il est donc possible que l'enzyme ne soit pas très spécifique quant à son substrat ou que la spécificité se fasse sur des sous-sites plus distants du site actif, c'est-à-dire les sous-sites +2 et supérieurs et/ou -2 et inférieurs. La seconde hypothèse est que les substrats utilisés ne soient pas les substrat réels de l'enzyme. En effet, il nous a fallu une très grande quantité d'enzyme (plusieurs mg) pour pouvoir produire ces oligo-saccharides. De plus, il n'a jamais été possible de détecter la production d'extrémités réductrices, et de suivre une cinétique de dégradation du carraghénane par l'enzyme Zg-3597. Cette enzyme est donc très faiblement active sur le ι-carraghénane. La dernière hypothèse est que l'échantillon de protéine de Zg-3597 ait été contaminé par de la iotase d'“A. fortis”. Cependant, la iotase d'“A. fortis” est connue pour être très spécifique du ι-carraghénane et n'accepte pas de motif DA dans ses sous-sites +1, +3, -2 et -4. ( Guibet et al., 2008 ). Les produits de dégradation de CgiA1_Af sont donc totalement différents de ceux observés sur le spectre RMN de la figure III_13. Il est donc raisonnable d'écarter l'hypothèse de la contamination.
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Etude structurale et fonctionnelle de la Quinolinate Synthase : une protéine fer-soufre cible d'agents antibactériens

Etude structurale et fonctionnelle de la Quinolinate Synthase : une protéine fer-soufre cible d'agents antibactériens

gluthation sépharose, la protéine NadB pure est ensuite passée sur cette même colonne, après incubation, les protéines sont éluées. L’analyse sur gel d’électrophorèse des protéines éluées a révélé la présence de NadB en faible quantité par rapport à NadA mettant en évidence une faible interaction entre les deux protéines (Marinoni I., 2008). L’information principale apportée par mon étude, et qui vient renforcer le fait qu’il n’existe pas de complexe NadA/NadB vient du fait que l’utilisation d’un rapport NadA/NadB de 1/1 n’est pas nécessaire pour obtenir une activité quinolinate synthase maximale. En effet, une activité maximale de NadA est atteinte lors de l’utilisation de dix fois moins de NadB que de NadA. On peut donc en faisant le bilan des différentes données disponibles dans la littérature exclure la formation d’un complexe entre NadA et NadB. On peut cependant proposer qu’un complexe transitoire entre les deux protéines puisse mener à un apport efficace et protégé de l’iminoaspartate directement utilisable par NadA.
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Etude fonctionnelle et structurale du régulateur floral LEAFY d'Arabidopsis thaliana

Etude fonctionnelle et structurale du régulateur floral LEAFY d'Arabidopsis thaliana

2. La coopérativité de liaison de LFY-C à l’ADN a-t-elle une réalité biologique? La coopérativité de liaison de LFY-C à l’ADN a été mise en évidence par technique d’EMSA réalisée avec des oligonucléotides AP1 et une gamme croissante de LFY-C faisant apparaître un complexe de deux protéines LFY par ADN toujours majoritaire par rapport à un plus petit complexe composé d’une seule protéine par ADN. De façon générale, cette coopérativité peut résulter de deux mécanismes distincts augmentant l’affinité de liaison du deuxième monomère à l’ADN, l’un mettant en jeu un changement conformationnel de l’ADN induit par la liaison du premier monomère, l’autre une dimérisation de la protéine sur l’ADN. Les données cristallographiques que nous avons obtenues ont montré que le mécanisme s’appliquant au cas de LFY-C était essentiellement une dimérisation de la protéine sur l’ADN impliquant deux résidus, l’His387 et l’Arg390. Ces données ouvrent une intéressante perspective d’étude car la coopérativité peut aider la mise en place de transitions développementales brutales et pourrait expliquer dans le cas présent la capacité de LFY à déclencher la transition florale. Il a été montré qu’une transition brutale demande de combiner coopérativité à une boucle d’autorégulation. La boucle d’autorégulation via l’activation d’AP1 qui réactive LFY est connue (Liljegren et al., 1999). La combinaison de ces deux propriétés est sans doute importante pour expliquer comment LFY, dont l’expression croit de façon progressive, arrive à induire de façon brutale l’induction d’AP1 et la transition florale. La question est désormais de valider si ce modèle a une réalité biologique, question qui s’applique à deux niveaux: i) la coopérativité s’observe-t-elle chez la protéine pleine longueur et ii) influe-t-elle sur la transition florale in planta ?
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Etude structurale et fonctionnelle des polysaccharidases de Rhodopirellula baltica

Etude structurale et fonctionnelle des polysaccharidases de Rhodopirellula baltica

Cations, PACT Suite, JCSG+, MDL I et MDL II. Les plaques ont été rempli avec un robot qui dispense des nano-gouttes assises. Ainsi 300 nL de protéines ont été mélangés avec 150 nL de solution de réservoir et ont été mis à équilibrer contre 100 µL de solution de réservoir. Les résultats ont globalement été assez comparables à ceux obtenus avec RB2160 : sur l’ensemble des conditions, quelques unes ont données des précipités microcristallins intéressants sans cependant qu’une tendance globale ne se dégage. Des purifications avec un tampon final légèrement différent (concentration plus faible de NaCl) ont également été testées mais n’ont permis d’identifier des conditions de cristallisation plus claire. A noter cependant qu’une vérification récente des boites de cristallogénèse du module UNK1 a révélé la croissance d’un petit cristal (par observation à la loupe binoculaire avec lentille réfringente). Cet objet ayant probablement grandi au cours des douze derniers mois, ce cristal fera prochainement l’objet d’une étude par spectrométrie de masse afin de vérifier si il ne s’agirait pas d’une version tronquée de la protéine, permettant une croissance cristalline sans une zone flanquante qui perturbait l’empilement cristallin au point d’inhiber la cristallisation. Ce module est après tout le seul de l’ensemble des cibles finales dont les délimitations ont été déterminés seulement par analyse bioinformatique, et il n’est pas impensable que ce type de séquence flanquante puisse exister.
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Dynamique structurale et fonctionnelle du domaine C-terminal de la protéine PB2 du virus de la grippe A

Dynamique structurale et fonctionnelle du domaine C-terminal de la protéine PB2 du virus de la grippe A

Une récente étude structurale du complexe formé par l’importine α humaine et le domaine NLS a confirmé que la présence du domaine IBB inhibe totalement ou partiellement l’interaction à haute affinité du domaine NLS avec les importines α1 ou α7 respectivement [Kobe, 1999, Pumroy et al., 2015]. De façon surprenante, cette inhibition n’est pas observée pour l’importine α3. En effet, les auteurs ont pu montrer grâce à des expériences de co-immunoprécipitation semi-quantitative, que dans le cas de cet isoforme, l’interaction aurait lieu indépendamment de la présence de l’IBB [Pumroy et al., 2015]. D’autre part, leurs résultats suggèrent que l’importine α3 est l’isoforme d’interaction préférentiel lorsque le domaine globulaire NLS est présent, ce dernier apportant un avantage topologique comparé au peptide NLS seul [Pumroy et al., 2015]. D’autres préférences du 627-NLS pour certains isoformes de l’importine α ont été identifiées dans de nombreuses études in vivo, et dépendent des souches utilisées et des mutations évolutives présentes (Revue par [Gabriel and Fodor, 2014]). De façon générale, la protéine PB2 issue de virus adaptés à l’homme a une préférence pour l’importine α7 tandis que celle issue de virus aviaires a une préférence pour l’importine α3. PB2 issue de virus H1N1, potentiellement en cours d’adaptation, est capable d’interagir avec les deux importines [Gabriel et al., 2011].
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Etude structurale et fonctionnelle de la phosphatase humaine PTPN4

Etude structurale et fonctionnelle de la phosphatase humaine PTPN4

1) Résumé   PTPN4   possède   une   fonction   anti-­‐apoptotique   dans   la   cellule.   L’interaction   de   son   domaine  PDZ  avec  un  peptide  contenant  un  PBM  abolit  sa  fonction  et  induit  l’apoptose   des  cellules.  Le  domaine  PDZ  de  PTPN4  est  situé  à  proximité  de  son  domaine  catalytique.   Nous   avons   montré   lors   de   cette   étude   que   ce   domaine   PDZ   a   la   capacité   d’inhiber   l’activité  catalytique  de  la  phosphatase  PTPN4.  La  fixation  d’un  ligand  au  domaine  PDZ   est   suffisante   pour   lever   cette   inhibition   catalytique.   Afin   de   comprendre   comment   le   domaine   PDZ   peut   contrôler   l’activité   de   PTPN4,   nous   avons   utilisé   un   ensemble   de   techniques   biophysiques   telles   que   l’ultracentrifugation   analytique,   le   SAXS   et   la   RMN.   Nous  avons  démontré  que  le  supramodule  PDZ-­‐PTP  adopte  une  conformation  compacte   et   monomérique   suggérant   un   mécanisme   de   régulation   intramoléculaire.   La   fixation   d’un   ligand   au   domaine   PDZ   perturbe   les   interactions   transitoires   entre   les   deux   domaines  et  rétablit  les  propriétés  catalytiques  de  PTPN4.  Nos  résultats  mettent  à  jour   pour  la  première  fois  un  mécanisme  d’autorégulation  d’une  tyrosine-­‐phosphatase  par  un   domaine   PDZ.   Cette   étude   améliore   nos   connaissances   sur   la   régulation   des   tyrosine-­‐ phosphatases   et   peut   s’appliquer   à   d’autres   tyrosine-­‐phosphatases   possédant   des   domaines   PDZ.   De   plus,   elle   renforce   la   notion   émergente   que   les   domaines   PDZ   peuvent,  au-­‐delà  de  leur  simple  fonction  de  domaine  d’architecture,  fonctionner  comme   des  régulateurs  des  fonctions  d’enzyme  et  ainsi  participer  à  la  régulation  dynamique  des   voies  de  signalisation  cellulaire.  
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Caractérisation fonctionnelle et structurale d’une protéine alternative mitochondriale : AltMiD51

Caractérisation fonctionnelle et structurale d’une protéine alternative mitochondriale : AltMiD51

Un résultat important de mon étude est que l’expression d’AltMiD51 induit la fission mitochondriale par un mécanisme qui dépend du domaine LYR. L’obtention de ce mutant inactif (LYR→AAA) est très important également, car il sert aussi comme contrôle de surexpression d’une protéine dans la matrice mitochondriale. Ainsi, cela montre que ce n’est pas la simple surexpression de la protéine AltMID51 dans la mitochondrie qui provoque la fragmentation, mais que la fragmentation serait la fonction de la protéine. Dans la littérature, il n’y a aucune mention que les protéines à domaine LYR induiraient la fragmentation mitochondriale ou y joueraient un rôle associé. Nous avons donc suggéré comme hypothèse que d’autres acides aminés étaient impliqués dans la fonction d’AltMiD51. Pour investiguer cette hypothèse, un nouveau mutant (W4A) a été sélectionné grâce à une approche bio- informatique, la reconstitution de l’évolution moléculaire (MER) d’AltMiD51. Brièvement, l’étude consistait à obtenir de l’information sur la structure primaire en utilisant la séquence en acides aminés d’AltMiD51 de 92 espèces, dans le but de déterminer des acides aminés importants (Figure 9). De cette étude, il a été possible de révéler que la région N-terminale serait plus propices à être impliquée dans une fonction que la région C-terminale (Figure 9A), ce qui corrobore l’effet de la mutation du domaine LYR qui est situé en Nter. Parmi les acides aminés les plus intéressants du N-terminal, le tryptophane (W4) est ressorti avec un fort score de conservation de 1.6 (bonne conservation >0.8), et une closeness de 1 (meilleur score). De plus, l’acide aminé W4 est unique à AltMiD51 et n’est pas présent dans la séquence des autres protéines LYRMs, ce qui en fait un choix encore plus intéressant. Les résultats obtenus démontrent que la mutation W4A inactive la fragmentation mitochondriale induite par AltMiD51.
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Etudes structurale et fonctionnelle de protéines impliquées dans la virulence chez S. pneumoniae et P. aeruginosa

Etudes structurale et fonctionnelle de protéines impliquées dans la virulence chez S. pneumoniae et P. aeruginosa

S. pneumoniae Introduction 32 III.2 Biogenèse des pili chez les bactéries à Gram-positif. La biogenèse des pili des bactéries à Gram-positif repose sur l’action spécifique d’enzymes, appelées les sortases (Ton-that et Schneewind, 2003). Un paragraphe particulier leur est dédié dans ce manuscrit car l’étude de ces enzymes dans la biogenèse du pilus est très importante. De plus, au cours de mon stage de Master II, j’ai participé à la caractérisation structurale de ces enzymes, projet initié en 2006 au sein de notre groupe. Ces enzymes sont des transpeptidases à cystéine et catalysent l’association covalente des pilines entre elles. Les sortases reconnaissent un motif particulier sur la protéine partenaire, il s’agit du motif LPxTG (Schneewind et al., 1992). La réaction de transpeptidation s’effectue en deux étapes. Une première étape où la chaine latérale de la cystéine catalytique conservée réalise une attaque nucléophile entre la thréonine et la glycine du motif LPxT-G formant ainsi un complexe acyl- enzyme covalent de séquence LPxT-C. Lorsque l’accepteur final de la réaction est a proximité, ce motif est de nouveau attaqué et la sortase perd son substrat au profit de l’accepteur. C’est la réaction de transpeptidation.
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Étude de l'interaction de la protéine prion avec Cbln1, une protéine de la famille C1q

Étude de l'interaction de la protéine prion avec Cbln1, une protéine de la famille C1q

- Recherche de la protéine 14.3.3 dans le LCR par western-blot. Ce marqueur a une très bonne sensibilité (>90%) pour la maladie de Creutzfeldt-Jakob [34]. Un résultat négatif doit toutefois conduire à un nouveau prélèvement quelques semaines plus tard. La protéine 14.3.3 a des rôles très divers : transduction de signaux mitogènes, apoptose, contrôle du cycle cellulaire, etc. [24]. Cependant, la signification physiopathologique de la présence de cette protéine de 30 kDa dans le LCR reste inconnue. Cette recherche est effectuée dans les laboratoires associés au réseau national de surveillance des maladies de Creutzfeldt- Jakob et maladies apparentées (http://creutzfeldt-jakob.aphp.fr). Des faux positifs sont possibles dans de nombreuses situations. Il s’agit de pathologies neurologiques diverses : accident vasculaire cérébral, sclérose en plaques, hémorragie méningée, encéphalites infectieuses, syndrome paranéoplasique, encéphalopathie toxique, etc. Cependant, le tableau clinique de ces pathologies diffère singulièrement des maladies à prion. Par conséquent, le dialogue clinico-biologique est un élément essentiel dans le diagnostic.
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Caractérisation biochimique et fonctionnelle du mutant T179N de l’aquaporine-2 humaine

Caractérisation biochimique et fonctionnelle du mutant T179N de l’aquaporine-2 humaine

4.3 Récupération fonctionnelle de mutants récessifs Dernièrement, certaines études ont démontré un degré de fonctionnalité pour certaines mutations d’AQP2 en ovocytes allant de partiel (V24A, D150E, K228E) (Guyon, Lussier et al. 2009, Leduc‐Nadeau, Lussier et al. 2010) à complet (P262L) (de Mattia, Savelkoul et al. 2004). Ainsi, il semblerait que certaines mutations récessives peuvent également générer des canaux à eau fonctionnels avec adressage membranaire effectif. Plus encore, ces formes semblent aussi pouvoir s’associer à la variante sauvage et, de ce fait, récupérer leur fonction. C’est dans cette perspective que nous avons effectué un test de récupération fonctionnelle (Fig. 3-A, B, et C en page 68) qui, à l’égard de T179N, démontre une capacité très élevée; alors qu’initialement totalement inactif, le mutant T179N démontre une forte capacité de récupération de fonction (83±7% AQP2-wt) une fois coexprimé avec la forme sauvage. À l’inverse, et tel qu’attendu, le mutant dominant R254Q présente une capacité d’inhibition (-45±13%), qui traduit l’entrave de l’activité de l’AQP2-wt. Pour mettre au clair ces observations, un test de stabilité (Fig. 4 en page 69) a de plus démontré une augmentation de la densité de T179N lorsqu’en présence de l’AQP2-wt, à l’opposé de celle des mutants R187C et R254Q qui est fléchie. Ce comportement inattendu pour T179N le classe parmi cette nouvelle catégorie de mutations récessives susceptibles à la récupération en condition hétérozygote (Leduc‐Nadeau, Lussier et al. 2010).
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Caractérisation structurale et fonctionnelle de PBP1b de Streptococcus pneumoniae et son implication dans la découverte de nouveaux inhibiteurs

Caractérisation structurale et fonctionnelle de PBP1b de Streptococcus pneumoniae et son implication dans la découverte de nouveaux inhibiteurs

Etudes du domaine glycosyltransférase de PBP1b Résultats et discussion L’expression du domaine GT_[74-321] s’effectue en corps d’inclusion et nécessite tout d’abord des étapes de lavage du culot bactérien (figure 70, pistes L1 à L4) suivies d’une étape de dénaturation en urée (figure 70, piste dénat) permettant la solubilisation de la protéine. L’étape de purification sur colonne Chelating-Sepharose permet de sélectionner les protéines contenant une étiquette poly-histidine et dans notre cas, le GT_[74-321] est élué à 50mM imidazole (figure 70, piste Chel-Sephar). A l’issue de cette étape de purification, le rendement atteint 18mg/L de culture. L’étape finale, la plus critique, semble être celle de renaturation qui correspond à l’élimination progressive de l’urée par dialyse à 4°C. Le pouvoir d’oxydoréduction (GSH-GSSG) ajusté par comparaison à certains protocoles de renaturation s’avère être un élément déterminant dans la renaturation du GT_[74-321], malgré l’absence de cystéine dans ce domaine. En effet, l’expérience effectuée sans ce pouvoir d’oxydoréduction conduit à la précipitation de la protéine. Après renaturation le GT_[74-321] ne reste pas stable longtemps et montre dans un premier temps une digestion par des protéases (figure 70, piste filt. gel) puis une agrégation (figure 73, courbe verte).
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Recollection et familiarité chez 12 patients présentant un infarctus thalamique gauche : étude comportementale, en imagerie structurale et fonctionnelle de repos

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Introduction. Cette étude a pour objet de mieux comprendre les mécanismes de l’amnésie thalamique. Le postulat de l’implication du thalamus dans la mémoire est motivé par les connexions qui relient le noyau antérieur du thalamus (NA) à l’hippocampe par le tractus mamillo-thalamique (TMT) (Papez, 1937). Ce petit faisceau dense en forme de boomerang découvert par Vicq d’Azyr en 1786 relie les corps mamillaires, eux-mêmes recevant des afférences de l’hippocampe, au NA (Aggleton et Brown, 1999). La notion de complexe NA/TMT s’est donc naturellement imposée dans les modèles neuro-anatomiques de la mémoire (Aggleton et al., 2011). De nombreuses études ont mis en avant la relation de causalité entre une lésion du NA/TMT et une amnésie (Ghika-Schmid et Bogousslavsky, 2000, Kishiyama et al., 2005, Carlesimo et al., 2011 pour revue). Les modèles ont évolué au gré des nouvelles données de la littérature, et des structures ont été ajoutées au réseau. Ainsi le noyau thalamique dorso-médian (DM) serait également impliqué dans les processus mnésiques en raison de ses connexions avec le cortex périrhinal connu pour son rôle dans la récupération des items uniques (Eichenbaum, 2007). Bien que les études testant cette hypothèse soient de plus en plus nombreuses chez l’homme, comme chez l’animal, aucun consensus n’émerge quant à la fonction du noyau DM dans la mémoire et dans la cognition en général (Mitchell et Chakraborty, 2013). Le but de cette étude était de tester le rôle respectif de ces structures (NA, TMT, DM) dans le déficit mnésique de patients présentant une lésion thalamique ischémique unilatérale gauche.
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Etude structurale de la Whirline, protéine modulaire cruciale dans les mécanismes de la vision et de l'audition

Etude structurale de la Whirline, protéine modulaire cruciale dans les mécanismes de la vision et de l'audition

à la partie C-terminale de la protéine, formant un complexe avec la Myosine-15a et Eps8. Nous nous intéresserons l’interaction avec Eps8 dans la section 8.3.2. 8.3.1 Changement de conformation Après avoir obtenu les deux conformations de HHD2, nous avons tenté d’induire, en solution, la transition de conformation du monomère vers le swapped-dimère. Il est généralement admis que les protéines Usher dimérisent ou oligomérisent pour effectuer leur fonction dans les stéréocils 68,183 . Les complexes protéiques impliqués dans les stéréocils effectuent leurs fonctions sans modification post-traductionnelle ; il existe donc des “interrupteurs” conformationnels permettant la transmission de l’information au sein de la cellule. Le domaine HHD2 de la Whirline nous semblait un bon candidat pour endosser cette fonction “interrupteur”, notamment dans l’isoforme courte de la Whirline. Nous avons fait varier le solvant contenant HHD2 pour obtenir des conditions favorables à la forme dimérique, sans succès jusqu’à présent. Voici une liste exhaustive des conditions testées : - Encombrement : favorable aux conformations exposant une surface minimum, il pourrait
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